SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2625-2010 病毒性脑病和视网膜病检疫规范 Quarantine protocol for viral encephalopathy and retinopathy 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T26252010 前 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）发布的《水生动物疫病诊断手册（ManualofDiagnostic TestsforAquaticAnimals）》（2006英文版）的第2.1.7章：病毒性脑病和视网膜病（CHAPTER 2.1.7.VIRALENCEPHALOPATHYANDRETINOPATHY)的诊断方法，并增加了实时荧光RT PCR检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈信忠、龚艳清、徐淑菲、孔繁德、谢明星、柯华生、王景明、周斌华。 I SN/T2625—2010 病毒性脑病和视网膜病检疫规范 1范围 本规程规定了鱼类病毒性脑病和视网膜病（又称病毒性神经坏死病）的实验室检测方法。 本规程适用于鱼类病毒性脑病和视网膜病病原的鉴定及其流行病学调查和监测。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3. 1 VER viral encephalopathyand retinopathy 病毒性脑病和视网膜病。 3. 2 VNNV viral nervous necrosis virus 病毒性神经坏死病毒。 3. 3 CPE Ecytopathiceffect 细胞病变作用。 3. 4 RT-PCR reverse-transcription polymerase chainreaction 逆转录聚合酶链式反应。 3.5 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素。 3. 6 Ct值 cyclethreshold 荧光信号达到设定的阅值所经历的扩增循环次数。 4 试剂和材料 4. 1 所有实验用试剂均为分析纯。TRIzol、Taq酶、逆转录酶、RNase抑制剂、dNTPs（含dATP、 1 SN/T2625—2010 dUTP、dCTP、dGTP)等核酸提取试剂、RT-PCR及荧光RT-PCR所需试剂可选用专业试剂公司提供的 商品化试剂及试剂盒。 4.2VER阳性对照由国家指定机构提供。 4.3SSN-1或E-11细胞。 4.4免抗-β野田村病毒血清由国家指定机构提供。 4.5 FITC标记的羊抗兔IgG抗体以及生物素标记的羊抗兔IgG抗体。 4.6 RT-PCR引物:VERR:5'-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3',VERF:5'-CGT-GTC- AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3'；荧光定量RT-PCR的引物：正向引物VERYF：5'-GGACCTCGTCGG- GAAAGGAG-3，反向引物VERYR：5"-GACACAGCACTGACACGTTGA-3，探针5*-(FAM)CGT- CACCTGGTCGGCTGATACTCCTGT-3*(TAMRA) 4.7 Davidson氏固定液（见附录A第A.1章） 4.8 二甲肿酸钠缓冲液（见附录A第A.2章） 4.9 戊二醛固定液（见附录A第A.3章） 4.10 胰蛋白酶-EDTA混合消化液（见附录A第A.4章） 4.11 细胞培养液（见附录A第A.5章）。 4.12 PBS(见附录A第A.6章）。 4. 13 PBST(见附录A第A.7章） 4.14 TBS（见附录A第A.8章） 4.15 TBE电泳缓冲液（见附录A第A.9章） 4.16 Spurr树脂。 4. 17 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，用于RNA提取及RT-PCR实验的水应进行 DEPC处理。 5 器材和设备 5.1 荧光定量PCR仪。 5.2 PCR扩增仪。 5.3 高速冷冻离心机。 5.4 电泳仪。 5.5 凝胶成像分析系统或紫外检测仪 5.6 微量可调移液器。 5.7 荧光显微镜。 5.8 倒置显微镜。 5.9 组织切片机。 5.10 微量细胞培养板。 5.11 具有符合SN/T1193的实验室。 6 显微镜检查 6.1 光学显微镜检查 6.1.1取样 活体解副取鱼类的眼、脑和脊索等神经组织。 2 SN/T2625—2010 6.1.2固定 迅速将组织切成厚度不超过3mm的组织块，用Davidson氏固定液固定2h以上。根据组织块大 小，固定时间可适当调整，或放置过夜，期间按需要更换一次固定液。临床样品也可用10%福尔马林固 定，长期保存。 6.1.3切片 固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）→85%乙醇（60min）-95%乙 醇（60min）→无水乙醇I（30min）→无水乙醇Ⅱ（30min）→二甲苯+无水乙醇（体积比1：1）（30min） 石蜡Ⅱ（15min）→石蜡包埋-→切片（根据组织块大小和种类，各步时间作适当调整）。切片厚度不超过 6 μm。 6.1.4切片处理染色 二甲苯（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1）（3min）→无水乙醇（3min）→95%乙醇（3min）→ 85%乙醇（3min）→70%乙醇（3min）→蒸馏水（5min）苏木素（60min）→伊红（5min）→蒸馏水（5min）→ 85%乙醇（5min）→95%乙醇（5min）=无水乙醇I（5min）→无水乙醇Ⅱ（5min）→二甲苯+无水乙醇 （体积比1：1）（5min）→二甲苯I（5min）一二甲苯Ⅱ（5min）申性树脂封片。 6.1.5结果判定 用普通显微镜观察，如果视网膜、脑和脊索等神经组织出现明显的空泡化和坏死病变，可初步判定 VER阳性。但一些鱼类个体感染VER的不同阶段，在视网膜和脑部病变可能不明显或空泡较少，应用 其他方法进行诊断。 6.2电镜检查 6.2.1负染色方法 6.2.1.1将新鲜或冷冻的眼、脑以及脊髓用 1%~2%的磷钨酸溶液（用氢氧化钾调至pH6.8）泡软，然 后涂沫在铜网上，在透射电镜下观察。 6.2.1.2负染的VER病毒大小约25nm~30nm，无囊膜，二十面体结构 6.2.2正染色方法 6.2.2.1活体取鱼类的脑、眼及脊索组织，用刀片切成约2mm×2mm×1mm的小块，迅速用2%的 冷戊二醛固定液固定24h以上、 6.2.2.2用二甲肿酸钠缓冲液冲洗3次，用1%的四氧化钱固定1h。 6.2.2.3丙酮逐级（70%、80%、90%、100%I、100%Ⅱ）脱水，每级丙酮中约10min，再放置于1：1 的100%丙酮和Spurr树脂混合液中，渗透过夜。 6.2.2.4Spurrs树脂渗透12h，包埋，超薄切片 6.2.2.5用1%乙酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，每次约30min。透射电镜观察。 6.2.2.6超薄切片中的VER病毒大小约22nm～34nm，成晶格状排列在细胞质中，或在细胞内外单 个或成团状存在，无囊膜，二十面体。 6.2.3 结果判定 电镜检查观察到大小、形态与VER病毒相似的病毒颗粒，可初步判定VER可疑，应用其他方法进 行确认。 3 SN/T2625—2010 7病毒分离 7.1采样 无症状鱼类取其脑、眼和肝、肾等组织，有临床症状的鱼类可取脑、脊索和眼晴视网膜组织，鱼苗及 较小的仔鱼用整条鱼。取样数量按照GB/T18088。 7.2样品处理 先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于培养液中。如果在匀浆前未 用抗菌素处理过样品，则应将样品匀浆后再悬浮于含有1000IU/mL青霉素和1000uμg/mL链霉素的 培养液中，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h~24h。7000r/min离心15min，收集上清液。 7.3细胞培养和观察 1：10、1：10°和1：10稀释度的上清液分别接种到生长24h以内的96孔板里的SSN-1或E-11细胞 单层中，每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃～20℃吸附0.5h～1h后，加人细胞培养液。 置于22℃培养。试验设2个阳性对照（接种VER标准株）和2个空白对照（未接种病毒的细胞）。 和24℃～26℃（参见附录B)生化培养箱中培养。 7.3.3每天用显微镜观察阳性对照和其他细胞培养物的变化，观察10d。阳性对照出现明显的CPE， 空白对照细胞生长正常，实验结果成立。当待检样品细胞培养物出现CPE时，继续进行病毒鉴定。如 果10d后仍未出现CPE，细胞培养物应进行传代。 7.3.4将需传代的细胞培养物冻融1次，5000g离心15min，收集上清液，接种于新的SSN-1或E-11 单层细胞，再培养观察10d。未出现CPE的样品可判定为阴性，出现CPE者应作进一步鉴定。 8病毒鉴定方法 8.11 间接荧光抗体测试 8.1.1 样品处理：细胞培养样品按7.3进行病毒细胞培养。弃培养液，用PBS洗涤1次，甲醇固定 10min，自然风干。临床组织样品制作冰冻切片，再用冷内酮固定。 8.1.2 加人兔抗-β