SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2576—2010 进出口蜂王浆中林可酰胺类 药物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of lincosamides residues in royal jelly for import and export-LC-MS/MS 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2576—2010 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国浙江出人境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：谢文、陈笑梅、丁慧瑛、钱艳、韩超。 SN/T2576—2010 进出口蜂王浆中林可酰胺类 药物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 范围 本标准规定了进出口蜂王浆中林可酰胺类药物残留量测定的制样和液相色谱-质谱/质谱测定 方法。 本标准适用于蜂王浆中林可霉繁、氯林可素和吡利薇素残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于体文件。 GB/T6682分析实验用水规格和试验方法 3方法提要 用甲醇沉淀样品中蛋白质，上清液加磷酸盐缓 种溶液稀释后， 固相萃取小柱净化，液相色谱-质 谱/质谱测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯水为GB/T6682规是的--级水。 4.1乙腈：高效液相色谱级。 4.2 甲醇：高效液相色谱级。 4.3甲酸：高效液相色谱级。 4.4氢氧化钠。 4.50.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1L。 4.6甲醇水溶液：甲醇十水（3十7，体积比）。 4.7磷酸盐缓冲溶液：溶解13.8g磷酸二氢钠于950mL水中，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液 pH值到8.0.最后用水稀释至1L。 林可素盐酸盐（Lincomycinhydrochloridemonhydrate，CASNo.859-18-7，分子式 4.8 CisH34NO.SxHCI)标准品：纯度大于等于99.5%。氮林可霉素盐酸盐（Clindamycinhydrochloride， CASNo.21462-39-5，分子式C1sH3CIN2OsSxHCI)标准品：纯度大于等于94.5%。吡利霉素盐酸盐 (Pirlimycinhydrochloride，CASNo.79548-73-5，分子式C，HaCINzOSxHCl）标准品：纯度大于等于 86.4%。 4.9林可霉素、氯林可霍素、吡利得紫标准储备溶液：分别称取经折算适量标准品（4.8），分别用甲醇溶 解定容至100mL，溶液浓度为100ug/ml.，1℃～4℃冰箱保存。有效期3个月。 1 SN/T2576—2010 4.10 4.11标准工作溶液：根据需要用空白样品提取液（4.10）将标准储备液稀释成浓度为2ng/mL、 5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/rnL的混合标准工作溶液，相当于样品中含有2μg/kg、 5μg/kg、10μg/kg、50ug/kg、100μg/kg林可酰胺类药物。 4.12Cg固相萃取小柱，500mg，3ml.或相当者。使用前依次用5ml.甲醇，5ml.水预洗。 4. 13 3微孔滤膜：0.45μm，有机相。 5仪器和设备 5.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2天平：感量为0.0001g和0.001g。 3固相萃取装置。 5.3 5.47 离心机：大于等于6000r/min。 5.5 pH计：测量精度士0.02pH单位。 5.6旋涡混合器。 5.7 减压浓缩仪 5.8 具塞离心管：聚四氟乙烯，50ml。 6 试样制备与保存 取500g代表性蜂王浆样品，在室温下解冻，等样品全部融化后搅匀，将试样均分成两份，分别装人 样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在一18℃保存。在制样的操作过程中，应防止 样品污染或发生残留物含量的变化。 7测定步骤 7.1提取 称取2g试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加10mL水，混匀，静置2min，再加甲醇至 20mL，于旋涡混合器上以2000r/min混匀1min，以6000r/min离心10min，过滤，移取10.0mL上 清液，加10mL磷酸盐缓冲溶液（4.7)稀释，混匀。 7.2净化 将溶液转移至C1s固相萃取小柱中（4.12），再用5mL水和5mL甲醇水溶液（4.6）依次洗涤浓缩 瓶，洗涤液过固相萃取小柱，弃去流出液，抽干，用6ml甲醇洗脱，控制流速1mL/min～2mL/min，收 集全部洗脱液于10mL离心管中，洗脱液在50℃以下水浴下减压浓缩至近干，用1.0mL甲醇-水（1十 1，体积比）溶解残渣，混匀，溶液过0.45um，滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱-串联质谱条件 a）仓 色谱柱：Cs柱，150mm×4.6mm（内径），5μm，或相当者： b) 流动相梯度洗脱程序见表1： 2 SN/T2576-2010 表.1 梯度洗脱程序 甲醇/% 0.15%甲酸水溶液/% 时间/min 25 75 0 2 25 75 75 25 2. 5 75 25 4.5 25 75 4. 6 10 25 75 c) 流速：0.4mL/min； d) 进样量：50μL； e) 离子源：电喷雾离子源； f) 扫描方式：正离子扫描： g) 检测方式：多反应监测； h) 雾化气压力（GS1）、气帘气压力（CUR）、辅助气流速（GS2）均为高纯氮气或其他合适气体；使 用前应调节各气体流量以及离子源温度（TEM)使质谱灵敏度达到检测要求，详细参考条件及 监测离子对（m/z)参见附录A。 7.3.2高效液相色谱-串联质谱测定 根据试样中被测样液的含量，选定浓度相近的混合基质标准溶液，待测物的响应值应在仪器检测的 线性范围内。对混合基质标准溶液及样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下林可素、氮林可 霉素和吡利霉素的参考保留时间分别约为8.4min、9.2min和9.2min，标准溶液的选择性离子流图参 见附录B中图B.1。 7.3.3定性测定 按照上述条件测定样品和混合基质标准工作液，如果检测的质量色谱峰保留时间与混合基质标准 工作液一致，允许偏差小于士2.5%。定性离子对的相对丰度与浓度相当混合基质标准工作液的相对丰 度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 >50 >20~50 >10~20 N10 相对离子丰度/% 允许的相对偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 7.3. 4 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 8结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中林可酰胺类药物的残留含量，计算结果需扣除空白值： X,-XV (1) m 3 SN/T 2576—2010 式中： X，-试样中林可酰胺类药物的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； -基质标准溶液中林可酰胺类药物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）： V- 一样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； 最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。 m- 9方法的测定低限(LOQ)和回收率 9. 1 测定低限 林可酰胺类药物的残留量测低限为5μg/kg。 9.2回收率 回收率的实验数据(在不同添加浓度范围内)见表3 表3 林可酰胺类药物添加回收率范围（n=6) 化合物 添加浓度（ug/kg） 回收率/% 5 80.8~101.2 林可霉素 10 78.4~102.0 79.0~107.0 20 77.8~109.0 氯林可薇索 10 73.8~98.7 20 77.0~ 96.0 77.2~102.4 吡利莓索 79.6~104.0 20 73.5~j01.0 SN/T2576—2010 附录A （资料性附录） API4000LC-MS/MS系统电喷雾离子源参考条件") API4000LC-MS/MS系统电喷雾离子源参考条件： 电喷雾电压（IS)：4800V； a) b) 雾化气压力（GS1)：289.59kPa(42psi)； c) 气帘气压力（CUR）：186.165kPa(27psi)； 辅助气流速（GS2）：310.295-kPa(45ps9 d) e) 离子源温度（TEM）：540℃； f) 碰撞气(CAD)：5； g) 去簇电压（DP）：90V； h) 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量(CE)及碰撞室出凸电压(CXP)见表A.1。 表A.1 定性离子对定冠离子对、碰撞气能量和碰撞室出口电压 定性需子对 碰描气能量（CF)！ 碰撞室出口电压(CXP)/ 名称 V V 2/iu 407.27126.3* 26 10 林可霉素 407.27359.4 8z 9 10 425.9/126.1 氯林可霉索 425. 9/378. 2 28 10 10 411.24 112.1 44 吡利霉素 411,2/363.1 24 10 a该离子对为定册离子对。 1）非商业性声明：附录A所列参数是在API4000质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并 不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。 5