SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2552.12—2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌 检测与计数 Microbiological examination for milk and milk products hygiene- Part 12:Detection and enumeration of listeria monocytogenes 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2552.12-2010 前言 SN/T2552《乳及乳制品卫生微生物学检验方法》分为十三个部分： 第1部分：取样指南； 第2部分：检验样品的制备与稀释； 第3部分：酵母、霉菌、菌落计数； 第4部分：嗜冷菌微生物菌落计数； 第5部分：沙门氏菌检验； 第6部分：柠檬酸杆菌检验； 第7部分：阴沟肠杆菌检验； 第8部分：普通变形杆菌和奇异变形杆菌检验； 第9部分：克雷伯氏菌检验； 第10部分：阪崎肠杆菌检验免疫荧光法； 第11部分：蜡样芽孢杆菌的分离与计数； 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数； 第13部分：假单孢菌属的分离与计数。 本部分是SN/T2552的第12部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分修改采用了ISO11290-1：1996/Amd.1：2004（E)《食品与动物饲料微生物学单核细胞增 生李斯特氏菌水平检测和计数方法第1部分：检测方法》（Microbiologyoffoodandanimalfeeding stuffs--Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes-Part l: Detectionmethod)和ISO11290-2：1998/Amd.1：2004(E)《食品与动物饲料微生物学单核细胞增生 李斯特氏菌水平检测和计数方法第2部分：计数方法》（Microbiologyoffoodandanimalfeeding stuffsHorizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes—Part2:Enu- merationmethod)的修订版，考虑到我国进出口检验检疫的实际应用情况，对其中-些内容进行了删 减，并增添了其他一些内容，主要差异如下： 按照GB/T1.1、GB/T20000.2要求和汉语习惯对一些编排格式进行了修改； 将一些国际标准的表述方式改为适用于我国标准的表述方式； 一删除了“目录”、“引言”、“定义”、“原则”和“参考文献”部分； -对规范性引用文件”的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改； 将“警告”改为“安全要求”，并放置到标准的末尾段： 一增加了PCR检测方法。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：王海艳、赵贵明、刘中学、刘振、刘虹、赵林立、敖威华。 I 建筑321---标准查询下载网 www. jz321. net SN/T2552.12—2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌 检测与计数 1范围 SN/T2552的本部分规定了乳及乳制品中单核细胞增生李斯特民菌检测和计数方法。 本部分适用于乳及乳制品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测和计数。其他食品中单核细胞增生李 斯特氏菌的检测和计数也可参照使用。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用手本文件。 SN/T2552.1乳及乳制品卫生微生物学检验方法第1部分取样指南 SN/T2552.2乳及乳制品卫生微生物学检验方法第2.部分验验样品的制备与稀释 3培养基和试剂 3.1HalfFraser肉汤：见附录A中第A.1章。 3.2 Fraser肉汤：见附录A中第A.2章。 3.3李斯特氏菌显色培养基琼脂（ALOA）：见附录A中第A.3章 3.4 牛津琼脂（OXA）：见附录A中第A.4章。 3.5 酵母浸膏胰酪大豆琼脂（TSA-YE)：见附录A中第A.5章。 3.6 酵母浸膏胰酪大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中第A.6章。 3.7 绵羊血琼脂：见附录A中第A.7章。 3.8 糖发酵培养基（木糖和鼠李糖)：见附录A中第A.8章。 3.9 动力培养基：见附录A中第A.9章。 3.10 协同溶血(CAMP)试验培养基和试验菌株：见附录A中第A.10章。 3. 11 3%过氧化氢（H2O2)溶液。 3.12 革兰氏染色液：见附录A中第A.11章。 3.13 引物：见附录A中第A.12章。 3.14 dNTP混合物：dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L。 3.15 10×Taq缓冲液。 3.16 TaqDNA聚合酶。 3. 17 琼脂糖（电泳级）。 3. 18 溴化乙锭溶液：见附录A中第A.13章。 3. 19 DNA分子量标记100bpDNALadderMarker。 3.20 50X电泳缓冲液：见附录A中第A.14章。 3.21 6X加样缓冲液：见附录A中第A.15章。 SN/T2552.12-2010 设备和材料 4. 1 高压灭菌器。 4. 2 恒温水浴箱：20℃±2℃，48℃士2℃。 4. 3 恒温培养箱：25℃±1℃，30℃±1℃，36℃±1℃。 pH计。 4. 4 4.5 生物显微镜：100×，1000×。 4.6 均质器。 4.7 微量加样器：1μL~10μL，100μL，200μL，1000μL。 4.8 高速冷冻离心机：最大离心力在12000g以上。 4.9 制冰机。 4.10 PCR仪。 4. 11 凝胶电泳装置及成像系统。 4.12 2李斯特氏菌标准菌株：单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19111、西尔李斯特氏菌ATCC35967、绵 羊李斯特氏菌ATCC19119、英诺克李斯特氏菌ATCC33090标准菌株和非李斯特菌属的标准菌株（如： 杆菌或链球菌）。 注：具有等同效果的标准菌株也可以采用。 5定性检测方法 5.1预增菌 单核细胞增生李斯特氏菌检测程序见图1。 取样和制样按照SN/T2552.1、SN/T2552.2执行。无菌取25g（mL)待检样品加入225mLHalf Fraser肉汤中，均质后，于30℃士1℃培养24h士3h。 预增菌后，将预增菌培养物按照5.2的方法转接于Fraser肉汤中进行增菌。同时按照5.3的方法 将预增菌培养物划线接种于固体选择培养基进行分离培养。 5.2增菌 取0.1mL预增菌培养物转接于10mLFraser肉汤中，于36℃土1℃培养48h士2h。 5.3分离培养 5.3.1划线接种 取5.1中的预增菌培养物或5.2中的增菌培养物分别划线接种于固体选择培养基ALOA和OXA 平板上，于36℃士1℃培养24h士3h后观察结果，如果菌落不明显或不典型，继续培养至48h士3h后 再观察结果。 5.3.2菌落观察 单核细胞增生李斯特氏菌在ALOA上生长24h士3h后，典型菌落特征为菌落呈现蓝色，周围有不 透明的晕圈。在培养48h士3h后，菌落增大，晕圈明显。 注1：有些单核细胞增生李斯特氏菌在ALOA上菌落周围的晕圈不明显甚至没有晕圈。还有些单核细胞增生李 斯特氏菌在ALOA琼脂上菌落周围的晕图出现的比较迟缓，有时需要4d以上才出现。 注2：绵羊李斯特氏菌在ALOA上的菌落形态与单核细胞增生李斯特氏菌相似。 建筑321---标准查询下载网 www. jz321.ne SN/T2552.12—2010 检样25g(mL) HalfFraser肉汤225mL 30℃±1℃,24h±3h 0.1mL转接于10mLFraser肉汤 36℃±1℃,48 h±2h 划线接种于固体选择培养基(ALOA，OXA） 36 ℃±1C,24 h±3 h~48 h±3 h 选取可疑菌落，划线接种于TSA-YE 36℃C±1℃,18 h~24 h 革兰氏染色 TSB-YE 动力试验 游血试验 PCR方法 糖发醇试 验(木糖、 鼠李糖) 阳性，再按照 5.4.3的检测程 序或已经得到认 可的商业化试剂 盒鉴定 结果报告 图1单核细胞增生李斯特氏菌检测程序 单核细胞增生李斯特氏菌在OXA上生长24h士3h后，典型菌落呈现灰色，直径约1mm左右，周 围有黑色的晕圈。在培养48h土3h后，菌落增大呈现黑色，并带有绿色光泽，菌落中心凹陷，直径约 2mm左右，菌落周围黑色的晕圈扩大。 5.4鉴定 5.4.1可疑菌纯分离培养 从5.3中的固体选择培养基平板上选取可疑菌落，每个平板选取5个以上，分别划线接种于TSA- YE平板，于36℃±1℃培养18h～24h。 在纯培养后，可以按照5.4.2用PCR方法进行鉴定，也可以按照5.4.3的检测程序进行鉴定。 3 SN/T2552.12—2010 5.4.2PCR方法 5.4.2.1细菌培养 从5.4.1中的TSA-YE平板上挑取纯分离培养的细菌接种于5mLTSB-YE中，于36℃士1℃培 养16h±2h。 5.4.2.2细菌DNA的提取 提取方法见附录B中的第B.1章。 5.4.2.3PCR扩增 PCR扩增体系和扩增条件见附录B中的第B.2章。防止交叉污染措施参见附