中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2436—2010 山羊和绵羊布鲁氏菌病检疫规程 Protocol of quarantine for Brucella in sheep and goat 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T2436—2010 前言 本标准参考0IE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2008版）第2.7.2章“山羊和绵羊布氏杆菌病” 和第2.7.9章“绵羊型布氏杆菌病”编写而成。 本标准的附录F、附录G为规范性附录，附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录H、附录I、附 录J为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫 局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王玉玲、姜红、赵林立、岳志芹、赵祥平、陈本龙、肖妍、葛含光、刘红梅、玉丽。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T2436-2010 山羊和绵羊布鲁氏菌病检疫规程 1范围 本标准规定了山羊和绵羊布鲁氏菌病的虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、酶联免 疫吸附试验、琼脂扩散试验等技术要求。 本标准适用于山羊和绵羊牛种、羊种、绵羊种布鲁氏菌病的检疫。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用规格和试验方法 GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 3概述 参见附录A。 4临床症状与病理变化 参见附录B。 5被检血清样品采集 5.1采血和分离 按常规方法采血和分离血清。血清应新鲜，无明显蛋白凝固、无溶血和无腐败气味。 5.2运送和保存 防止血清冻结和受热，若3d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4℃冰箱内 保存备用。 6 实验室检验 6.1山羊和绵羊牛种、羊种布氏杆菌病 6.1.1虎红平板凝集试验（rosebengalplateagglutinationtest，RBT) 6.1.1.1试剂和材料 6.1.1.1.1抗原：按说明书使用，使用前置室温（22℃~25℃)30min～60min，并充分摇勾。 6.1.1.1.2阳性对照血清：冻干品，使用前按说明用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.1.1.3阴性对照血清：冻干品，使用前按说明用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.1.1.4玻璃板：约45cmX30cm，要求洁净，划成32个方格，横数8个格，纵数4个格，每格4cmX 4cm，每一格下再划1cm宽的小格，用于填写血清号。 6.1.1.1.5牙签：扁形圆头或类似小棒。 6.1.1.1.6移液器：吸取量25μL、75μL。 6.1.1.2试验程序 6.1.1.2.1试验前血清应置室温（22℃~25℃)30min~60min。 SN/T2436—2010 6.1.1.2.2将玻璃板上各格标上被检血清号，然后加入相应的被检血清75μL。 6.1.1.2.3在被检血清旁加25μL虎红平板凝集抗原。 6.1.1.2.4用牙签搅动被检血清和抗原使之均匀混合，形成直径约2cm的液区。轻微摇动，室温下于 4min内观察结果，同时作阳性血清和阴性血清对照。 6.1.1.2.5每次操作以不超过20份血清样品为宜，以免样品干燥而不易观察结果。 6.1.1.3判定 当阴性血清对照不出现凝集（一），阳性血清对照出现凝集（十）时，则试验成立，可以判定。否则应 重做。 在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（十），不出现凝集者判为阴性（一）。 出现阳性反应的样品，还需经补体结合试验或其他辅助试验方可定性。 6.1.2试管凝集试验（tubeagglultinationtest，SAT） 6.1.2.1试剂和材料 6.1.2.1.1稀释液：0.5%石碳酸的10%盐溶液（含0.5%石碳酸、10%氯化钠溶液）。 6.1.2.1.2抗原：按照说明书使用。使用时充分摇匀，用稀释液作1：20工作浓度）稀释。 6.1.2.1.3阳性对照血清：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.2.1.4 阴性对照血清：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.2.1.5试管架。 6.1.2.1.6玻璃试管：规格为13mm×100mm，圆底，洁净。 6.1.2.1.7微量移液器。 6.1.2.1.8可调连续加样器。 6.1.2.2试验程序 6.1.2.2.1稀释被检血清 被检血清的最终稀释度为1：25、1：50、1：100、1：200。大规模检疫时可用1：25、1：50稀释 度。为测定强阳性血清效价，稀释度可以增加。 每份被检血清用4支试管，标记检验编号后第1管加1.15mL稀释液，第2～4管各加入0.5mL 稀释液。取被检血清0.1mL，加人第1管，充分混匀后吸弃0.25mL。从第1管中吸取0.5mL加人到 第2管，混合均匀后，再从第2管吸取0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去 0.5mL，稀释完毕。从第1至第4管的血清稀释度分别为1：12.5、1：25、1：50、1：100。 6.1.2.2.2加抗原 将0.5mL抗原(1：20)加入已稀释好的各血清管中，并振摇均匀。各管血清稀释度则依次变为 1：25、1：50、1：100、1：200。各反应管反应总量为1mL。 6.1.2.2.3设立对照 每次试验都应设立下列对照。 阴性对照：阴性对照血清的稀释和加抗原的方法与被检血清同。 阳性对照：阳性对照血清的最高稀释度应超过其效价滴度，加抗原的方法与被检血清同。 抗原对照：在0.5mL稀释液中，加0.5mL抗原（1：20）。 6.1.2.2.4配制比浊管 每次试验均应配制比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将抗原（1：20)用等量稀释液作一倍 稀释，然后按表1配制比浊管。 2 SN/T2436—2010 表1 比浊管的配制 试管号 1 2 3 4 5 抗原稀释液1：40 1. 00 0. 50 0. 25 0 0. 75 0.5%石碳酸生理盐水 0, 25 0. 50 0 0. 75 1, 00 清亮度/% 0 25 50 75 100 凝集度标记 + ++ +++ ++++ 注：十十十+完全凝集，菌体100%下沉，上层液体100%清亮。十十十几乎完全凝集，上层液体75%清亮。十十 凝集很显著，液体50%清亮。十有沉淀，液体25%清亮。一无沉淀，液体不清亮。 6.1.2.2.5感作 所有试验管充分振荡后，置37℃温箱感作20h。 6.1.2.3判定 比照比浊管判读，出现十十以上凝集现象的最高血清稀释度为血清凝集价。 当阴性血清对照和抗原对照不出现凝集（一），阳性血清的凝集价达到其标准效价土1个滴度，则证 明试验成立，可以判定。否则，试验应重做。 山羊和绵羊于1：50血清稀释度出现“十十”以上的凝集现象时，被检血清判定为阳性反应。 需要采用国际凝集单位表示试验结果时，可参照附录C中的换算公式换算成国际凝集单位。 6.1.3·补体结合试验（complementfixationtest，CFT） 6.1.3.1试剂和材料 6.1.3.1.1试剂 6.1.3.1.1.1蒸馏水：GB/T6682中的三级水。 6.1.3.1.1.2 稀释液：灭菌生理盐水。 6.1.3.1.1.3 补体结合抗原：按说明书使用，使用前充分摇匀。 6.1.3.1.1. 4 阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.3.1.1.5 阴性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.3.1.1.6 溶血素：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 6.1.3.1.1.7 补体：使用前用蒸馅水溶解至规定容积。 6.1.3.1.1.8 绵羊全血：选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，60mL阿氏液中加人40mL血，混匀，4℃ 冰箱内保存5d后备用。 6.1.3.1.2材料 6.1.3.1.2.1 玻璃试管：10mm×75mm，圆底，洁净。 6.1.3.1.2.2 试管架。 6.1.3.1.2.3 可调微量移液器。 6.1.3.1.2.4 可调连续加样器。 6.1.3.1.2.5 96孔“U”型微量板。 6.1.3.1.2.6 96孔平底（LJ)微量板。 6.1.3.1.2.7 水平转子离心机。 6.1.3.1.2.8 酶标仪。 6.1.3.1.2.9 水浴箱。 6.1.3.2预备试验 6.1.3.2.13%绵羊红细胞悬浮液的制备 6.1.3.2.1.1绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机500g离心5min， 最后一次离心10min。 3 SN/T2436—2010 6.1.3.2.1.2取1份下沉血泥加人到24份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬浮液， 6.1.3.2.1.4取100μL加人到平底微量板孔内，纵向加8个孔。 6.1.3.2.1.5用酶标仪540nm下读OD值，算出平均OD值，代人校正红细胞浓度见式（1)： BXC A= ·(1) 0.115 式中： A- 一稀释液加人量； 平均OD值； C红细胞悬浮液量。 6.1.3.2.1.6取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加人到红细胞悬浮液中即得3%红细胞悬浮液。 6.1.3.2.2溶血素效价的测定 6.1.3.2.2.1稀释溶血素 同稀释倍数的溶