SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1151.4—2011 代替SN/T1151.4—2003 虾黄头病检疫技术规范 Quarantine protocol for shrimp yellow head disease 2011-12-01实施 2011-05-31发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 虾黄头病检疫技术规范 SN/T1151.4—2011 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张0.75 字数17千字 2011年11月第一版 2011年11月第一次印刷 印数1—1600 * 书号：155066·2-22585 定价16.00元 SN/T 1151.4—2011 前言 SN/T1151系列标准共分为6部分： 虾桃拉综合征检疫技术规范； 对虾白斑病检疫技术规范； 一斑节对虾杆状病毒（MBV)诊断方法； —虾黄头病检疫技术规范； 对虾杆状病毒(BP)检验方法； 一 一对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。 本部分为SN/T1151的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分代替SN/T1151.4一2003《对虾黄头病毒（YHV)逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测方 法》。 本部分与SN/T1151.4相比，主要技术变化如下： 新增套式RT-PCR鉴别诊断方法； 新增Real-timeRT-PCR检测方法。 本部分修改采用世界动物卫生组织（OIE)的《水生动物疾病诊断手册》（2009版）第2.2.7章。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：熊炜、蒋静、张强、刘、李健、王巧全、邱璐、黄忠荣、胡永强。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： -SN/T1151.4—2003。 1 SN/T 1151.4—2011 虾黄头病检疫技术规范 1范围 SN/T1151的本部分规定了虾黄头病RT-PCR和Real-timeRT-PCR检测的操作方法 本部分适用于虾黄头病流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 3概述 虾黄头病（Yellowheaddisease，YHD)是一种由虾黄头病毒（Yellowheadvirus，YHV）引起的严重 威胁虾养殖的疫病，其感染广泛、致死率高，是世界动物卫生组织（OIE)规定的需上报的水生动物疫病。 目前仅有斑节对虾和南美白对虾大规模爆发YHD疫情的报道，但日本对虾、白对虾、南极磷虾等也能 自然感染YHV。YHV属于黄头症候群病毒（Yellowheadcomplexofviruses），目前该群病毒有6个 已知的基因型，YHV（基因1型）是其中的一个型，并且是黄头病的唯一病原。鳃联病毒（Gill- associatedvirus，GAV)属于基因2型。GAV和其他几个型（基因3型～6型）在东非、亚洲和澳大利亚 的健康斑节对虾中比较常见，但很少引发疾病。YHV为有囊膜的杆状病毒，其基因组为单正链RNA。 4试剂和材料 4.11 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。 4.2逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U/μL，一20℃保存，避免反复冻融 4.3RNA酶抑制剂（40U/μL）：-20℃保存，避免反复冻融 4.4dNTP：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。 4.5RT-PCR引物：浓度为20μmol/L,其序列如下： 引I物（10F):5-CCG-CTA-ATT-TCA-AAA-ACT-ACG-3'; 引I物（144R):5'-AAG-GTG-TTA-TGT-CGA-GGA-AGT-3'; 引物(GY1):5'-GAC-ATC-ACT-CCA-GAC-AAC-ATC-TG-3'; 引物(GY2):5-CAT-CTG-TCC-AGA-AGG-CGT-CTA-TGA-3'; FI物(GY4):5"-GTG-AAG-TCC-ATG-TGT-GTG-AGA-CG-3; 引I物(GY5):5'-GAG-CTG-GAA-TTC-AGT-GAG-AGA-ACA-3'; 引I物(Y3):5'-ACG-CTC-TGT-GAC-AAG-CAT-GAA-GTT-3'; 引物(G6):5'-GTA-GTA-GAG-ACG-AGT-GAC-ACC-TAT-3'; 1 SN/T1151.4—2011 引物（YC-R1ab):5*-TCT-TCR-CGT-GTG-AAC-ACY-TTC-TTR-GC-3*和 5'-TCT-GCG-TGG-GTG-AAC-ACC-TTC-TTG-GC-3'两种引物混合; 5'-CGC-TTY-CAR-TGT-ATC-TGC-ATG-CAC-CA-3'; 引物（YC-R2ab):5'-RTC-DGT-GTA-CAT-GTT-TGA-GAG-TTT-GTT-3和 5"-GTC-AGT-GTA-CAT-ATT-GGA-GAG-TTT-RTT-3'; 简并碱基为:R(AG),Y(CT),M(AC),K(GT),S(GC),W(AT),H(ACT),B(GCT),V(AGC),D (AGT),N(AGCT) 4.6Real-timeRT-PCR的引物和探针：引物浓度为20umol/L，探针浓度为10μmol/L，其序列如下： 上游引物(YHVF):5'-AGG-CGT-CTA-TGA-CTT-CGA-GAC-AT-3'; 下游引物（YHVR):5'-ACG-GCG-TTG-AGA-GCT-TTG-AT-3'； FAM和TAMRA。 4.7随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50umol/L，一20℃保存 4.8DNA相对分子质量标准：适合检测相对分子质量大小100bp1000bp间的DNA片段，一20℃ 保存。 4.910倍电泳上样缓冲液：4℃保存。 4.10DEPC水：自配（见A.1)或购买商品化试剂。 4.111 EB溶液：4℃保存（见A.2）。 4.12Trizol试剂：4℃保存。 4.13三氯甲烷：常温保存。 4.14异丙醇：使用前预冷至一20℃。 4.1575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。 5仪器与设备 5.1荧光PCR检测仪：ABI7700、ABI7500或相同功能荧光PCR检测仪。 5.2普通PCR仪：ABI9700或相同功能普通PCR仪。 5.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达13000g以上。 6临床症状的诊断 虾在幼虾晚期以后对YHV最易感，在虾苗早期至晚期阶段的死亡率最高。YHD爆发时，患病虾 停止摄食、集聚于池边或在水表游动，死虾外表发白，头胸甲因肝胰腺变黄呈现黄色，与正常虾棕色的 肝胰腺相比较软，但这些症状并不是YHD所特有的。一且有虾出现YHD的临床症状并开始死亡，几 天内就可出现很高的死亡率（可达100%）。处于YHV慢性感染期的虾，几乎没有明显的体症，行为和 摄食正常，但病毒在淋巴器官中保持持续感染，可能会终生带毒，可把病毒水平传播给其他易感虾。 7买 采样和样品前处理 7.1采样 出境检疫采样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池)进行，采样数量 根据GB/T18088确定。采集送实验室检测的样品可以为稚虾、半成虾和成虾。采集的样品应保持鲜 SN/T 1151.4—2011 活，0℃～4℃冷藏保存。 7.2样品前处理 7.2.1随机取5只～10只新鲜的虾作为采样标本，采集的部位包括：虾头部的鳃丝、肝胰腺、淋巴器官 或血淋巴等组织（可部分或全部采集这些组织）。对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作为样品；虾粪便直 接匀浆待检。 7.2.2取鳃丝时，用灭菌过的剪刀去除头部两侧的头胸甲，露出鳃丝，然后用剪刀剪取鳃丝。 7.2.3取肝胰腺时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，露 出内部的组织器官，其中深褐色的组织为肝胰腺，用剪力剪取整块肝胰腺组织。 7.2.4取淋巴器官时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉， 暴露出内部的组织器官，在胃的腹侧、肝胰腺的后面，取出白色、呈二裂片状的淋巴器官。 7.2.5取血淋巴时，先用1mL医用注射器吸取500μL柠檬酸盐溶液（见A，3），然后使虾腹部朝上， 将针头水平插入正数第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处，然后缓慢吸取 血淋巴。 7.2.6将采集的样品，按每克样品加人1mLTN缓冲液（见A.4），然后用玻璃匀浆器将样品匀浆。将 匀浆液转移至1.5mL离心管中，4℃2000g离心5min，吸取上清液备用。 7.3阳性对照样品和阴性对照样品的处理 鲜活阳性对照样品和阴性对照样品的采样和样品前处理同待检样品，将鲜活样品中取出的组织样 处理。 8RNA抽提 分别取100μL待检样品匀浆上清液，以及YHV阳性样品和阴性样品的上清液，加人1mLTrizol 试剂，用枪头充分吹打20次