(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211200484.5 (22)申请日 2022.09.29 (71)申请人 上海医药集团青岛国风药业股份有 限公司 地址 266000 山东省青岛市经济技 术开发 区松花江路18号 (72)发明人 常艳旭　李晋　杜昆泽　郝佳　 袁宏伟　何俊　房士明　文佳柯　 王辉　陈建　郭彩杰　李彦　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 专利代理师 李筝 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/08(2006.01)G01N 30/06(2006.01) G01N 30/58(2006.01) B01D 15/10(2006.01) B01D 57/02(2006.01) (54)发明名称 基于LVSS-MSS-CDEKC的生物碱分析方法及 在养心氏片质量控制中的应用 (57)摘要 本发明涉及基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱 分析方法及在养心氏片质量控制中的应用。 本发 明将LVSS和MSS两种富集方法结合构建一种两步 堆积策略， 基于由环糊精修饰的毛细管电动色谱 分离模式对养心氏片中的阳离子生物碱成分进 行分析， 并实现对不同批次养心氏片样品的含量 测定研究。 为获得最佳的应用性能， 对LVSS ‑MSS‑ CDEKC方法涉及的相关实验参数进行了优化， 且 一系列的方法学验证结果表明该方法具有较好 的准确性和稳定性。 综上所述， 本发明所建立的 LVSS‑MSS‑CDEKC方法准确、 稳定、 可靠， 较系统地 测定了养心氏片中的多种生物碱成分， 为养心氏 片的质量评价及药效机制研究提供了一定的参 考价值。 权利要求书1页 说明书11页 附图3页 CN 115541754 A 2022.12.30 CN 115541754 A 1.一种基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 所述分析方法用于同时 检测待测样品中的表小檗碱、 脱氢紫堇碱、 药根碱、 黄连碱和 小檗碱， 所述LVSS ‑MSS‑CDEKC 电泳运行模式如下： 将运行缓冲溶液充满毛细管柱， 一定压力下注入SDS胶束 溶液及待测样 品， 最后在毛细管柱前端引入甲醇溶 液， 施加分离电压对待测样品中的生物碱进行分离 。 2.如权利要求1所述基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 所述运行缓 冲液为NaH2PO4缓冲液， 浓度为20～40mM， pH为2～3， 缓冲液中还包括10～20mg/mL的羟丙基 ‑ β‑环糊精。 3.如权利要求1所述基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 所述毛细管 柱为未涂层的石英毛细管柱， 有效长度应达到40cm以上， 内径为45～66μm； 上述分析运行 前， 所述毛细管柱经过预处理， 步骤如下： 采用0.08～0.12M  NaOH溶液和水依次冲洗1～ 3min以活化毛细管内壁， 电泳运行 前还需要采用运行缓冲溶 液对毛细管进行冲洗2 ～4min。 4.如权利要求1所述基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 所述SDS胶 束溶液为含有15～25mM  SDS的NaH2PO4缓冲液； 所述SDS胶束溶液的注入 压力为45～55mbar， 注入时间为 4～6s。 5.如权利要求1所述基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 所述待测样 品采用50～99％甲醇溶液作为溶剂进行提取； 所述待测样品的注入压力为45～55mbar， 注 入时间为25～3 5s。 6.如权利要求1所述基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 所述毛细管 前端注入甲醇溶 液的浓度为 45～55％， 注入压力为 45～55mbar， 注入时间为 4～6s； 或， 所述分离电压为23～ 27kV。 7.如权利要求1所述基于LVSS ‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方法， 其特征在于， 上述生物碱 样品分析过程还包括采用检测器对分离后 样品中生物碱进 行检测， 所述检测器为紫外检测 器， 检测温度为2 2～27℃， 检测波长为2 20～240nm。 8.权利要求1 ‑7任一项所述分析方法在养心氏片质量控制方面的应用， 其特征在于， 所 述分析方法的应用方式如下： 基于权利要求1 ‑7任一项所述分析方法对多个批次的养心氏 片进行分析获得包含上述生物碱的信息的谱图， 经过数据处理获得基于生物碱的对照 指纹 图谱； 将待测养心氏片按照权利要求 1‑7任一项所述方法进 行分析获得样品指纹图谱， 并与 对照指纹图谱进行相似性比对， 实现对待测养心氏片的质量控制。 9.一种养心氏片中生物碱含量的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包括权利要求 1‑7任一项所述分析 方法对养心氏片进行分析的步骤。 10.如权利要求9所述养心氏片中生物碱含量的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法 还包括对照品及供试品的配置， 所述对照品为表小檗碱、 脱氢紫堇碱、 药根碱、 黄连碱和小 檗碱标准品的混合溶 液， 所述供 试品为养心氏片的 甲醇提取 液； 所述供试品溶液的具体配制方式如下： 取待测养心氏片， 去除包衣后研磨成粉末， 精密 称定该药物粉末并且加入甲醇溶液中进行超声提取， 冷却后定容得到样品提取液， 将所述 样品提取 液离心并过 滤得到供试品溶液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541754 A 2基于LVSS‑MSS‑CDEKC的生物碱分析方 法及在养心氏片质量控 制中的应用 技术领域 [0001]本发明属于生物碱分析方法技术领域， 具体涉及一种基于大体积样品堆积 ‑胶束 到溶剂堆积 ‑环糊精电动色谱法(LVSS ‑MSS‑CDEKC)的生物碱分析方法及所述分析方法在养 心氏片质量控制方面的应用。 背景技术 [0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003]心血管疾病(CVDs)是一种心脏血管和周围血管疾病的统称， 严重威胁着人类生命 健康， 具有高发病率、 高致残率和高死亡率的特点。 经调研发现， 我国的心血管疾病患者数 量在逐年上升， 且患病群体不再仅仅局限于中老年人， 而逐渐向年轻化趋势发展。 养心氏片 是一种用于临床治疗冠心病、 心绞痛、 心肌梗死、 高血脂或高血糖等症状的传统中药制剂， 由黄芪、 人参、 丹参、 党参、 葛根、 淫羊藿、 山楂、 地黄、 当归、 黄连、 延胡索(炙)、 灵芝和甘草 (炙)等13味中药组成。 中药制剂的化学成分复杂多样， 且临床疗效的发挥是多种化学成分 协同作用的结果。 然而在2020年版 《中国药典》 中仅对黄芪甲苷的含量标准进行了规定， 这 似乎不能满足有效控制 养心氏片质量以及探讨药理作用机制的要求。 因此,一些研究者基 于HPLC‑DAD技术建立有效的分析方法， 成功实现了多种 化学成分 的同时测 定。 但其分析时 间长， 效率低， 且目标成分主要集中于黄酮类和酚酸类化合物。 Zhu等人采用HPLC ‑ESI‑Q‑ TOF‑MS虽实现了对黄酮类、 酚酸类、 生物碱等多种成分的同时测定， 但 缺乏定量分析。 此外， 养心氏片 中的生物碱成分已被预测是治疗心血管疾病的活性成分之一。 基于此， 亟需建立 高效、 快速的分析 方法对养心氏片中的生物碱成分开展系统研究。 [0004]毛细管电泳技术(CE)因操作简单、 分析时间快、 有机溶剂消耗少等优点， 已被广泛 应用于医药， 食品及化工等领域。 近些年来， 各种在线样品预浓缩技术不断被开发， 无需额 外的设备， 在一定程度上解决了传统电泳分离模式灵敏度低的问题。 大体积样品堆积 (LVSS)是指通过引入较长的样品溶液来使样品加载量最大化， 以此获得提高的富集效率。 此两种方法已被证明即使在复杂的样品分析中亦能实现一定的高效性。 胶束到溶剂堆积 (MSS)是一种对阳离子或阴离子成分实现富集的方法， 主要机理是基于带电分析物在富含 有机溶剂的边界处发生有效电泳迁移率的反转， 整个过程主要涉及分析物的迁移、 释放和 积累。 当LVSS与MSS耦合时， 分散在样品区域的离子组分在MSS过程中会被重新聚焦， 从而在 一定程度上提高了堆积效率和分离性能。 发明内容 [0005]本发明将大体积样品堆积(LVSS)和胶束到溶剂堆积(MSS)两种富集方法结合构建 一种两步堆积策 略， 基于由环糊精修饰的毛细管电动 色谱分离模式(CDEKC)对养心氏片中说　明　书 1/11 页 3 CN 115541754 A 3