(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211159293.9 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 北京豪思生物科技股份有限公司 地址 102200 北京市昌平区回龙观镇科 学 园路7号院1号楼1层102-2 申请人 江苏豪思睦可生物科技有限公司 　 江苏豪思生物科技有限公司 (72)发明人 周立　李云龙　栗琳　邵立军　 孙敬茹　丁亮　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 张金铭 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01)G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 含乳样本中脂溶性维生素的检测方法和试 剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种含乳样本中脂溶性维生 素的检测方法和试剂盒， 涉及脂溶性维生素检测 的技术领域。 该检测方法主要用于检测维生素A 和维生素E， 主要是通过皂化水解酯化形式的维 生素A和维生素E， 并通过液液萃取的方式萃取出 样品中的维生素A和维生素E， 最后运用先进的液 相色谱串联质谱(LC ‑MS/MS)技术对含乳样本中 的两种脂 溶性维生素(VA和V E)进行定量检测。 该 检测方法具有高选择性、 高特异性、 高灵敏度的 优点， 能够准确检测含乳样本中维生素A和维生 素E两种化合物， 能够准确评估含乳样本中维生 素A和维生素E的含量情况。 权利要求书3页 说明书15页 附图4页 CN 115524419 A 2022.12.27 CN 115524419 A 1.含乳样本 中脂溶性维生素的检测方法， 其特征在于， 所述脂溶性维生素包括维生素A 和维生素E； 所述检测方法包括： 将待测样本与内标和保护剂混合， 然后进行皂化处理， 再采用萃取 液萃取经皂化处理的样本， 经吹氮和复溶后使用LC ‑MS/MS法检测经前处理的样本， 将检测 值带入标准曲线中， 计算得到样本中的维生素A和维生素E 。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述保护剂包括 抗氧化剂； 优选地， 所述 抗氧化剂包括 抗坏血酸或抗坏血酸盐； 和， BHT或BHA； 优选地， 所述 抗坏血酸盐选自抗坏血酸钠； 优选地， 所述 抗氧化剂包括 抗坏血酸钠和BHT； 优选地， 在皂化处理的步骤中， 混合体系中的抗坏血酸钠的浓度为2～ 10mg/ml； 优选为 5～5.5mg/ml； 优选地， 在皂化处理的步骤中， 混合体系中的BHT浓度为0.05～0.1％w/v， 优选为0.05 ～0.055％w/v； 优选地， 向待测样本中加入100mg/mL抗坏血酸钠的水溶液和含0.1％BHT的无水乙醇至 目标浓度， 再进行皂化处 理。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述皂化处理的条件为： 将待测样本 与碱混合， 在5 0～90℃的温度条件下加热20～40mi n； 优选地， 在80℃的温度条件下加热3 0min； 优选地， 皂化处 理的温度环境由金属浴提供； 优选地， 向待测样本中加入碱溶 液， 使体系中碱的终浓度为0.5～ 2.5M； 优选地， 所述碱溶 液选自氢 氧化钠溶 液或氢氧化钾溶 液。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述萃取 液选自正己烷； 优选地， 所述萃取 液和所述待测样本的体积比为1： (5～10)； 优选为1:9； 优选地， 萃取 液的用量 为500～1000 μL； 优选地， 所述采用萃取液萃取经皂化处理 的样本包括向冷却的经所述皂化处理 的混合 体系中加入萃取 液， 震荡混合后离心； 优选地， 所述震荡混合 为涡旋振荡3～5mi n； 优选地， 所述离心的条件为120 00～15000rpm离心10～ 20min。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 用于复溶的复溶液为含有甲酸的乙腈 水溶液； 优选地， 所述乙腈水 溶液中乙腈和水的体积比为(85～ 95)： 10， 优选为90:10； 优选地， 按照体积百分比计， 所述复溶 液中含有0.1～0.5％的 甲酸， 优选为0.1％。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述内标包括维生素A 的内标和维生 素E的内标； 所述维生素A的内标为Retinol ‑d4； 所述维生素E的内标为DL ‑α‑Tocopherol ‑ d6； 优选地， 所述标准曲线为标准曲线工作液中外标的含量与外标的检测值的对应关系； 所述外标包括 维生素A的外标和维生素E的外标； 所述 维生素A的外标为视黄 醇； 所述维生素 E的外标为 生育酚； 优选地， 所述标准曲线以标准曲线工作液中外标与内标的色谱峰面积比为因变量； 以权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115524419 A 2外标的浓度为自变量； 用加权最小二乘法对自变量与因变量进行线性回归； 优选地， 所述标准曲线工作液以含有抗氧化剂的无 水乙醇为溶剂； 优选地， 所述标准曲线工作液中含有0.05～0.5％w/v的BHT， 优选为含有0.1％w/v的 BHT； 优选地， 所述标准曲线工作液中维生素A的外标的浓度范围为20～10 00ng/mL； 优选地， 所述标准曲线工作液中维生素E的外标的浓度范围为0.4～ 20 μg/mL。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 色谱条件为： 液相色谱采用 梯度洗脱程序， 流动相A和流动相B按照体积比， 梯度洗脱程序为： 0.00min， 流动相A  20％， 流动相B  80％； 0.30min， 流动相A  20％， 流动相B  80％； 1.00min， 流动相A  0％， 流动相B  100％； 2.00min， 流动相A  0％， 流动相B  100％； 2.01min， 流动相A  20％， 流动相B  80％； 3.00min， 流动相A  20％， 流动相B  80％； 其中， 流动相A为水相， 流动相B为有机相； 优选地， 所述 流动相A为含有甲酸的水 溶液； 优选地， 所述 流动相A中甲酸的浓度为0.0 5～0.5％v/v； 优选为0.1％v/v； 优选地， 所述 流动相B为含有甲酸和乙酸铵的 甲醇溶液； 优选地， 所述 流动相B中甲酸的浓度为0.0 5～0.5％v/v； 优选为0.1％v/v； 优选地， 所述 流动相B中乙酸铵的浓度为1～5mM； 优选为2mM； 优选地， 色谱柱选自Shim ‑pack GIST C 8。 8.根据权利要求1 ‑6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 质谱条件为： 离子化模式： ESI； 采集模式： 正离子； 气帘气： 2 0psi； 离子源气体1： 45psi； 离子源气体2： 45psi； 离子源喷 雾电压： 5 500V； 离子源温度： 5 50℃； 碰撞气： 10un it； 离子信息如下： 化合物通道标*作为定量离 子。 9.根据权利要求1 ‑6任一项所述的检测方法， 其特征在于， 所述含乳样本包括生乳、 乳 粉或复原乳 。 10.用于检测含乳样本 中脂溶性维生素的试剂 盒， 其特征在于， 包括保护剂、 萃取液、 复 溶液、 内标准品试剂和外标准品试剂； 保护剂包括 抗坏血酸或抗坏血酸盐； 和， BHT或BHA； 萃取液为正己烷； 复溶液为含有甲酸的乙腈水溶液； 复溶液中 乙腈和水的体积比为(85～95)： 10， 按照体权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115524419 A 3