(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211151197.X (22)申请日 2022.09.21 (71)申请人 广西壮族自治区水 牛研究所 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市 兴宁 区邕武路24 号 (72)发明人 郭艳霞　杨承剑　谢华德　彭丽娟　 李孟伟　彭开屏　唐振华　谢芳　 (74)专利代理 机构 广西中知华誉知识产权代理 有限公司 45140 专利代理师 陆妙松 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01)G01N 30/34(2006.01) G01N 30/60(2006.01) G01N 30/68(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种青贮饲料中乙醇的气相 色谱检测方法， 选定特定优化的气相色谱条件， 以水为溶剂， 以正丙醇为内标物， 乙醇标准溶液 浓度在0.3μg/mL～160μg/mL范围内呈良好的 线性相关， 线性方程： y＝0.0388x ‑0.0246， 相关 系数为0.9999， 试验方法的精密度、 稳定性、 重复 性良好， RSD分别为0.54％、 0.57％、 0.63％， 检 出 限为0 .1μg/mL； 样品加标平均回收率为 99.31％， RSD为2.64％， 该方法操作简单、 干扰 少、 准确度高、 精密度好、 回收率高， 可用于青贮 饲料中乙醇的测定 。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 115372519 A 2022.11.22 CN 115372519 A 1.一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： 1)样品前处理： 青贮饲料样品剪碎后， 称取20g于500mL三角瓶 中， 加入200mL水， 超声提 取20min， 在1000r/min转速下离心5min， 得上清液， 再将上清液抽真空过0.45 μm微孔滤膜， 滤液置冰箱冷藏备用； 取滤液2mL于离心管中， 在 12000r/min转速下离心15min， 得上清液， 再将上清液抽真空过0.45 μm微孔滤膜； 处理好的样品取900 μL于气相进样瓶中， 加 入100 μL 正丙醇， 混匀， 准备 上机； 2)气相色谱条件： 仪器为Agilent  7890A型气相色谱仪； 色谱柱型号： HP ‑INNOWAX毛细管气相色谱柱， 规 格： 30m×0.25mm×25μm； 型号： 19091N ‑133； 载气： 氮气； FID检测器温度： 200℃； 进样口温 度： 180℃； 程序升温： 初始温度为40℃， 持续6min后以3℃/min的速率升至55℃， 持续2min后 再以7℃/min的速率升至120℃， 再持续2min； 载气流速： 1mL/min； 氢气流速： 40mL/min； 空气 流速： 400mL/min； 分流比： 5:1； 进样量： 1.0 μL； 3)标准溶 液的配制与曲线绘制： 乙醇储备液： 准确称取乙醇32mg于10mL容量瓶中， 用蒸馏水定容， 得到浓度为3200μg/ mL储备液， 置冰箱冷藏保存； 乙醇标准溶液配制： 取乙醇储备液5mL于10mL容量瓶 中， 用蒸馏水定容， 然后倍比稀释， 配制成浓度分别为16 00、 800、 400、 200、 100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.125ug/mL的标准品； 内标正丙醇储备液： 准确称取正丙醇2.0mg于10mL容量瓶中， 用蒸馏水定容， 得到浓度 为200 μg/mL的内标储备 液， 置冰箱冷藏保存； 内标法标准溶液配制： 分别准确量取不同浓度的乙醇标准溶液各1mL于10mL容量瓶中， 再分别加内标储备液1mL， 用蒸馏水定容， 得到一系列乙醇标准溶液160、 80、 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.312 5ug/mL， 其中内标正丙醇的浓度为2 0ug/mL； 将配制好的标准溶液置 冰箱冷藏保存待用； 按照色谱条件进行气相测定， 用乙醇浓度为横坐标， 乙醇与正丙醇峰面积比值为纵坐 标建立气相色谱标准曲线； 4)进行精密度试验、 稳定性试验、 重复性试验和回收率试验。 2.根据权利要求1所述的一种青贮饲 料中乙醇的气相色谱检测方法， 其特征在于： 步骤 3)所述的氮气， 纯度≥9 9.999％。 3.根据权利要求1所述的一种青贮饲 料中乙醇的气相色谱检测方法， 其特征在于： 步骤 4)所述的精密度试验， 是在步骤2)的 的色谱条件下， 用20 μg/mL乙醇标准溶 液连续测定 6次。 4.根据权利要求1所述的一种青贮饲 料中乙醇的气相色谱检测方法， 其特征在于： 步骤 4)所述的稳定性试验， 是在步骤2)的的色谱条件下， 用20 μg/mL乙醇标准溶液放置0、 2、 4、 8、 16、 24h测定 6次。 5.根据权利要求1所述的一种青贮饲 料中乙醇的气相色谱检测方法， 其特征在于： 步骤 4)所述的重复性试验， 是在步骤2)的 的色谱条件下， 用20 μg/mL乙醇标准溶 液做6个平行。 6.根据权利要求1所述的一种青贮饲 料中乙醇的气相色谱检测方法， 其特征在于： 步骤 4)所述的回收率试验， 准备已知不同浓度的青贮发酵液样品6份， 分别加入相同体积的乙醇 标准储备 液， 按照步骤2)的色谱条件操作。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115372519 A 2一种青贮饲料 中乙醇的气相色谱检测方 法 【技术领域】 [0001]本发明涉及乙醇检测技术领域， 具体涉及 一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方 法。 【背景技术】 [0002]乙醇在常温常压下是一种易燃、 易挥发的无色透明液体， 低毒性， 纯液体不可直接 饮用； 具有特殊香 味， 并略带刺激； 微甘， 并伴有刺激的辛辣滋 味。 乙醇的用途很广， 可用乙 醇制造醋酸、 饮料、 香精、 染料、 燃料等， 医疗上也常用体积分数为70 ‑75％的乙醇作消毒剂 等， 乙醇在国防化工、 医疗卫 生、 食品工业、 工农业 生产中都有广泛的应用。 [0003]青贮是在密封无氧的状态下， 将可溶性碳水化合物发酵生成各种 终产物， 以此达 到长期保存青绿饲料营养特性的一种方法。 测量pH及发酵终产 物(有机酸和醇类)是评价青 贮发酵的基本方法。 乳酸和乙酸是发酵过程中对主要的两种酸， 含量较高。 乳酸和挥发性脂 肪酸(乙酸、 丙酸和丁酸)通常采用高效液相色谱和气相色谱法分析。 乙醇是青贮中最常见 的一种醇类物质， 它可由多种微生物(异型发酵乳酸菌、 肠杆菌和酵母)产生， 通常在 全株玉 米青贮和豆科青贮中含量较低(0.5 ‑1.5％)。 摄入的乙醇在瘤胃中可被转化为乙酸或被瘤 胃壁所吸收， 从而转化为乳脂或用于新陈代谢和生长。 青贮饲料若含有高浓度的乙醇(3 ‑ 4％)， 通常与酵母的大量繁殖密不可分， 一些酵母可消耗乳酸， 造成干物质的大量流失， 引 起青贮变质， 甚至影响牛奶的风味。 [0004]目前已有相关的研究， 例如中国专利申请 号202111113291.1一种基于气相色谱 法 的测定酒类中乙醇含量的方法， 包括试样前 处理步骤和色谱检测步骤： 其中， 所述试样前 处 理步骤中内标物为叔戊醇； 所述色谱检测步骤中仪器参考条件如下： 进样口和检测器温度： 250℃； 载气流量： 1.0mL/min； 吹扫流量： 3.0mL/min； 分流比： 1： 99； 尾吹流量： 30mL/min； 氢 气流量： 40mL/min； 空气流量： 400mL/min， 该 发明的检测方法基于GB5009.2 66‑2016 《食品安 全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》 第三法， 通过优化色谱条件和以叔戊醇作为内标物， 加速 标准使用溶 液和样品溶 液的溶解均匀性， 缩短了样品处 理时间， 提高测量的准确度。 [0005]总的来说， 目前乙醇的测定多用气相色谱法(GC)法， 但现有方法测定的物系中乙 醇含量较高， 或者水含量较低。 而青贮的发酵液中存在大量的水和酸， 且乙醇含量较低， 这 些势必对乙醇的分离和 测定造成很大的干扰。 【发明内容】 [0006]针对现有技术中青贮的发酵液中存在大量的水和酸， 且乙醇含量较低， 对乙醇的 分离和测定造成很大的干扰的问题， 本发明提供了一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方 法， 通过选择适宜的色谱 条件， 对样液稍加处理， 选用合适内标物， 成功的达到了快速、 准确 测定青贮饲料发酵 液微量乙醇的目的。 [0007]本发明的目的通过以下技 术方案实现： [0008]一种青贮饲料中乙醇的气相色谱检测方法， 包括如下步骤：说　明　书 1/5 页 3 CN 115372519 A 3