(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211134534.4 (22)申请日 2022.09.19 (71)申请人 中国人民解 放军联勤保障部队第九 四〇医院 地址 730050 甘肃省兰州市七里河区南滨 河路333号 (72)发明人 高峰　邹敏　冯锦凯　张妍生　 高华　吴伟强　徐明　唐立垚　 涂浩　 (74)专利代理 机构 宁波海曙甬睿专利代理事务 所(普通合伙) 33330 专利代理师 殷秀花 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/54(2006.01)G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) G06K 9/62(2022.01) (54)发明名称 一种鉴别结直肠癌中 医证型的构建方法 (57)摘要 本发明提供了一种鉴别结直肠癌中医证型 的方法， 涉及代谢组学技术领域。 本发明提供结 直肠癌湿热蕴结证、 瘀毒内阻证、 脾虚气滞证、 肝 肾阴虚证、 气血两虚证血清样本； 测定上述血清 样本的代谢 组学图谱， 构建正交偏最小二乘判别 分析(OPLS  DA)模型。 本发明利用液相 色谱质谱 联用(LC‑MS)技术结合常规的数据处理软件和数 据建模软件即可进行模型的构建， 构建方法简 单， 一次分析即可快速、 准确地鉴别结直肠癌不 同中医证型， 具有广阔的应用前 景。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 115436521 A 2022.12.06 CN 115436521 A 1.一种结直肠癌中 医证型鉴别模型的构建方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 提供结直肠癌湿热蕴结证、 瘀毒内阻证、 脾虚气滞证、 肝肾阴虚证、 气血两虚证血清样 本； 将待检血清样本采用LC ‑MS血清代谢组学技术进 行分析， 得到待检血清样本的原始代谢 指纹图谱； 将原始代谢指纹图谱进行图谱预 处理， 得到可以用于统计分析的代谢物信息； 将 每组差异代谢物信息导入血清代谢组学分析模型中， 找出该代谢物信息在血清代谢组学分 析模型中的位置， 用于分析待检血清样本的代谢组学情况； 所述血清 代谢组学分析模型的构建方法包括以下步骤： (1)收集结直肠癌湿热蕴结证、 瘀毒内阻证、 脾虚气滞证、 肝肾阴虚证、 气血两虚证血清 样本， 作为分析样本； (2)将每个分析样本采用LC ‑MS血清代谢组学技 术进行分析， 得到原 始代谢指纹图谱； (3)将原始代谢指纹图谱进行图谱预处理， 进行主成分分析和偏最小二乘判别分析， 得 OPLS‑DA模型， 对得到的OPLS ‑DA模型进行验证， 无过拟合危险， 则所得OPLS ‑DA模型即为鉴 别结直肠癌中 医证型的血清 代谢组学分析模型。 2.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 所述的构建鉴 别结直肠癌中医证型血清代谢组学分析模型或对待检血清样本进 行LC‑MS血清代谢组学技 术进行分析时， 液相色谱所用色谱柱为 HSST31.8 μm(2.1 ×150mm)色谱柱， 自 动进样器温度 设为8℃， 以0.25mL/min的流速， 40℃的柱温， 进样2 μL进行梯度洗脱， 流动相 为正离子0.1％甲酸水(C) ‑0.1％甲酸乙腈(D)； 负离子5mM甲酸铵水(A) ‑乙腈(B)； 梯度洗脱 程序为0～1min， 2％B/D； 1～9min， 2％～50％B/D； 9～12min， 50％～98％B/D； 12～13.5min， 98％B/D； 13.5～14min， 98％～2％B/D； 14～20min， 2％D ‑正模式(14～17min， 2％B ‑负模 式)。 3.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 所述的构建鉴 别结直肠癌中医证型血清代谢组学分析模型或对待检血清样本进 行LC‑MS血清代谢组学技 术进行分析时， 质谱检测 仪器使用电喷雾离子源(ESI)， 正负离子电离模式， 正离子喷雾电 压为3.50kV， 负离子喷雾电压为2.50kV， 鞘气30arb， 辅助气 10arb。 毛细管温度325℃， 以分 辨率70000进行全扫描， 扫描范围100～1000， 并采用HCD进行二级裂解， 碰撞电压为30eV， 同 时采用动态排除去除无必要的MS/ MS信息。 4.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征是： 所述 OPLS‑DA模型的自变量的可解释度(R2X)为0.281cum， 因变量的可解释度(R2 Y)为0.977cum， 模型的可 预测度(Q2)为0.69 2cum。 5.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征是： 构建 血清代谢组学分析模型时， 所述 不同证型 结直肠癌 患者血清样本均来自3 6‑88岁人群。 6.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征是： 构建 血清代谢组学分析模型时， 所述 不同证型 血清样本109个。 7.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征是： 构建 血清代谢组学分析模型时， 进行LC ‑MS血清代谢组学技术分析时， 在检测时利用质量控制 (QC)样本进行质控， 所述质量控制样 品为我们从每个待测样 品中提取20 μL， 并将其混合为 QC样品。 8.根据权利要求5所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征是： 构建权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115436521 A 2血清代谢组学分析模型或对待检血清样本进行LC ‑MS血清代谢组学技术进行分析时， 所述 分析样本、 质量控制样品和待检血清样本进样前进行以下处 理： (1)分别将所述不同证型结直肠癌血清样本与甲醇混合， 将所得混合液依次进行涡旋 振荡、 离心， 取 上清液浓 缩干燥， 得到血清 代谢物； (2)将所述血清代谢物与2 ‑氯苯丙氨酸、 80％甲醇溶液混合， 将所得混合液依次进行涡 旋振荡、 离心、 过 滤， 得到上清液； 取 所述上清液进行LC ‑MS检测， 得到代谢物谱图。 9.根据权利要求6所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征在于， 所 述不同证型结直肠癌血清样本加 入甲醇的纯度为≥99.0％， 量为400 μL( ‑20℃)。 2‑氯苯丙 氨酸的浓度为98.5％， 量为150μL。 步骤(1)中涡旋振荡的时间为3～15min； 离心的速度为 12000rpm， 温度为 4℃， 时间为10mi n； 浓缩为真空浓 缩。 10.根据权利要求1所述的一种结直肠癌中医证型鉴别模型的构建方法， 其特征是： 对 待检血清样 本或分析样 本的原始代谢指纹图谱进行图谱 预处理是指： 通过Pr oteowizard软 件将获得的原始数据转换成mzXML格式(xcms输入文件格式)。 利用R(v3.3.2)的XCMS程序包 进行峰识别、 峰过滤、 峰对齐。 得到包括质核比和保留时间及峰面积等信息的数据矩阵； 导 出数据进行后续分析。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115436521 A 3