(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202211171513.X (22)申请日 2022.09.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 115267013 A (43)申请公布日 2022.11.01 (73)专利权人 广州市乾相生物科技有限公司 地址 510260 广东省广州市海珠区新港西 路135号大院中大蒲园区628栋中大科 技园A座自编号1510室 专利权人 山东乾肽生物科技有限公司 (72)发明人 王海梅　张志乾　王嘉鹏　吴奕瑞　 傅伟　朱家平　江翱　邱益　王帆　 崔华　谭洪群　(74)专利代理 机构 北京佰亦知识产权代理事务 所(普通合伙) 16097 专利代理师 陈柳叶 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/36(2006.01) 审查员 肖锡峰 (54)发明名称 一种适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分析方 法 (57)摘要 本发明涉及一种适用于多种棕榈酰基肽的 HPLC分析方法， 其特征在于： 第一步： 配制一个或 多个待测棕榈酰基肽样品的溶液， 所述棕榈酰基 肽样品可以是单一种棕榈酰基肽或多种棕榈酰 基肽的混合物； 第二步： 根据配制的待测棕榈酰 基肽样品的种类， 设定液相色谱条件； 第三步： 配 制分析用流动相； 第四步： 采用分析程序对其中 一个待测棕榈酰基肽样品进行测定； 第五步： 采 用流动相B清洗色谱柱1~5min； 第六步： 重复第四 步和第五步， 对其他未测的待测棕榈酰基肽样品 依次进行测定。 本发明的适用于多种棕榈酰基肽 的HPLC分析方法操作简单， 连续 分离测定多种棕 榈酰基肽时， 节约大量的时间成本和经济成本， 对多种棕榈酰基肽具有 普适性。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115267013 B 2022.12.13 CN 115267013 B 1.一种适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分离方法， 其特 征在于： 第一步： 配制多个待测棕榈酰基肽样品的溶液， 所述棕榈酰基肽样品是单一种棕榈酰 基肽； 第二步： 根据配制的待测棕榈酰基肽样品的种类， 设定液相色谱条件； 第三步： 配制分析用流动相； 第四步： 采用分析程序对其中一个待测棕榈酰基肽样品进行测定； 第五步： 采用流动相B清洗色谱柱1~5min； 第六步： 重复第四步和第五步， 对其 他未测的待测棕榈酰基肽样品依次进行测定； 其中： 对于所述分析用流动相， 流动相A为0.2%磷酸水溶液， 用三 乙胺调pH至3.5； 流动相B为 甲醇； 分析程序为 等度洗脱， 洗脱浓度： 流动相A： 15%， 流动相B： 85%； 所述色谱柱为 填料为C18的色谱柱； 所述棕榈酰基肽为棕榈酰三肽 ‑1、 棕榈酰三肽 ‑5、 棕榈酰三肽 ‑8、 棕榈酰四肽 ‑7、 棕榈 酰五肽‑4。 2.根据权利要求1所述的适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 所述待 测棕榈酰基肽样品依照如下比例进行配制， 称取0.008~0.012g棕榈酰基肽， 根据需要加入0 ~8.5mL甲醇， 再加 入0.2mL磷酸,所述棕榈酰基肽溶解后加 入超纯水补充至10mL， 溶解后即 得浓度为0.0 008~0.0012g/ml的所述待测棕榈酰基肽样品的溶 液。 3.根据权利要求2所述的适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 所述待 测棕榈酰基肽样品的浓度为0.0 01g/ml。 4.根据权利要求1或2所述的适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 波 长范围为20 0~300nm。 5.根据权利要求1或2所述的适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 流 速为1 mL/min。 6.根据权利要求1或2所述的适用于多种棕榈酰基肽的HPLC分离方法， 其特征在于： 色 谱柱柱温为室温， 进样量为8~15μL， 进样器温度为环境温度， 待测样品采集时间为10~ 30min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115267013 B 2一种适用于多种棕榈酰基肽的HPL C分析方法 技术领域 [0001]本发明属于分析化学领域， 具体涉及一种适用于多种棕榈酰基肽的高效液相色谱 法(HPLC)分析 方法。 背景技术 [0002]现有技术中， 对于肽 类的HPLC分析方法已有很多报道， 然而， 关于棕榈酰基肽的分 析方法鲜有报道。 棕榈酰基肽由于较正常肽类多了一个棕榈酰基修饰， 导致肽本身的性质 发生了较大变化， 通常用的肽类分析方法已不再适用于棕榈酰基肽。 现有技术文件CN   106546673  A中公开了一种利用高效液相色谱法分离棕榈酰 五胜肽‑3的方法， 然而， 该方法 为了改善色谱 峰峰形和分离效果， 在流动相里添加 三氟乙酸。 这样会导致最终产品中酸类 或三氟乙酸有残留， 使产品呈现酸性并能闻到明显的酸味， 而一些肽类实际在酸性条件下 并不稳定， 影响其储存时间。 再者， 由于三氟乙酸是强酸， 对色谱柱的耐受性有很高要求， 一 般色谱柱无法承受强酸， 需采用强化型色谱柱。 [0003]此外， 现有技术中也鲜有使用一种通用的HPLC方法进行多种肽的连续分离测定。 一般是每种肽对应一个专一的方法， 不仅使得流动相 配制工作繁琐， 而且所需试剂种类繁 多， 无论从管理上还是从所需空间上都需要很大的投入。 例如： 肽1用的流动相是甲醇和水， 而用的分析程序是程序1， 用的色谱柱是硅胶柱， 分析时间为10min； 而肽2用的流动相是乙 腈和水， 而用的分析程序是程序2， 用的色谱柱为十八烷基柱， 分析时间为10min。 当分析完 肽1后切换成分析肽2时， 不仅要对硅胶柱进 行清洗， 然后换成十 八烷基柱， 更要配制乙腈和 水流动相， 再对十八烷基柱进行前期清洗， 而后再对其进行平衡， 这就需要花费大概2小时 的时间。 然而分析时间其实只需要10min， 这前后会造成大量的时间成本浪费。 如果能对其 方法进行统一， 由于更 换方法导致的2小时的浪费时间里还可以分析12个样品。 [0004]已有相关文献报道： 不同的肽类使用不同的流动相， 如： 乙腈或甲醇与水的配比从 而达到分离的目的。 同时也有使用纯有机试剂或无机盐的相关报道。 但这些方法均只能满 足一种肽或蛋白， 并不通用于大部分肽类或蛋白质类， 而且使用无机盐时如果冲洗不彻底 极易造成仪器或色谱柱堵塞， 给后续工作带来困扰。 [0005]在以往的工作 中， 肽类分析时很容易出现几种肽不能完全分离 的情况， 而在分析 肽类含量时又要求必须完全分离， 否则无法准确计算肽的含量。 同时， 分析多种肽类时通常 每种肽对应一种方法， 包括分析程序， 流动相成分及配比。 使得操作步骤复杂繁琐。 [0006]本发明人经过长期深入的研究， 并未发现可以连续性分析多种棕榈酰基肽的HP LC 分析方法的报道。 [0007]因此， 亟待研究探寻一种更加通用的高效液相色谱法， 对更多种类的棕榈酰基肽 具有普适 性。 发明内容 [0008]发明要解决的问题说　明　书 1/6 页 3 CN 115267013 B 3