(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211154379.2 (22)申请日 2022.09.21 (71)申请人 首都医科 大学附属北京朝阳医院 地址 100020 北京市朝阳区工人体 育场南 路8号 (72)发明人 张瑞　石洁　王清涛　王默　 岳育红　张顺利　宋旖川　赵瑞　 傅雯萱　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 赵静 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/20(2006.01)G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种血清同型半胱氨 酸的测量方法、 候选标 准物质及制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种血清同型半胱氨酸的测 量方法、 候选标准物质及制备方法。 所述方法包 括下述步骤： （1） 调节所述双进样针稀释仪左侧 体积是450 ‑550μl， 右侧体积是50μl， 添加450 ‑ 550μl的5mg/ml  DTT溶液 （含0.001mol/L  NaOH） 和50μl血清样本， 震荡混匀5 ‑10分钟， 室温静置 15‑30min； b） 调节双进样针稀释仪左侧体积是 1400‑1500μl， 右侧体积是50μl， 添加1400 ‑ 1500μl的乙腈溶液 （含0.1%乙酸） 和50μl 的20 μmol/L的d4‑Hcy工作液， 震荡混匀15 ‑30分钟； c） 离心取上清； d） 将所述上清氮气吹干， 用甲醇 水溶液复溶， 混匀， 即得处理后的血清样本； （2） 采用高效液相色谱质谱法进行检测。 权利要求书2页 说明书17页 附图3页 CN 115236245 A 2022.10.25 CN 115236245 A 1.一种血清同型半胱氨酸的测量方法， 包括下述 步骤： （1） 血清样本前处 理 采用双进样针稀释仪在同一支安 瓿瓶中进行 血清样本处 理； a） 还原： 调节所述双进样针稀释仪左侧体积是450 ‑550μl， 右侧体积是50μl， 在此模式 下， 添加450 ‑550 μl的5.5mg/ml  DL‑二硫苏糖醇(DTT)溶液和50 μl待测血清样本， 震荡混匀 5‑10分钟， 室温静置15 ‑30min； 使用前调节所述DT T溶液的pH值 为7‑9； b） 蛋白沉淀： 调节所述双进样针稀释仪左侧体积是1400 ‑1500μl， 右侧体积是50μl， 在 此模式下， 添加1400 ‑1500 μl的乙腈溶液和50 μl的20 μmol/L的同位素氘标记的同型半胱氨 酸工作液， 震荡混匀15 ‑30分钟； 其中， 所述乙腈溶 液中含体积分数0.1%的乙酸； c） 离心取 上清； d） 将所述上清 氮气吹干， 用甲醇水 溶液复溶， 混匀， 即得处 理后的血清样本； （2） 采用高效液相色谱质谱法进行检测 对所述处理后的血清样本采用高效液相色谱质谱法进行检测， 测定血清样本中同型半 胱氨酸的浓度。 2.根据权利要求1所述的测量方法， 其特征在于： 所述步骤c） 中， 离心的条件为离心机 3600r/min离心5分钟。 3.根据权利要求1所述的测量方法， 其特征在于： 所述步骤d） 中， 所述甲醇水溶液中甲 醇与水的体积比为1:1， 所述甲醇水 溶液中含体积分数0.1%的乙酸； 所述步骤d） 中， 所述上清的取样体积为280μl， 氮气吹干后用所述甲醇水溶液复溶至 300 μl。 4.根据权利要求1所述的测量方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中，  所述检测中采用的 高效液相色谱条件如下： 色谱柱为Supelcosi l LC‑CN HPLC柱， 规格为25 cm×4.6mm， 5 μm； 柱温为30℃， 流速为0.5  mL/min， 进样量 为2 μl； 流动相为如下流动相A和流动相B， 采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱； 流 动相A为含体积分数0.1%的乙酸的去离 子水， 流动相B为含体积分数0.1%乙酸的 甲醇； 所述梯度洗脱的流 程如下： 0→7min， 体积分数10%的流动相B； 7 →9min， 体积分数10%的流动相B →100%流动相B； 9 →12min， 100%B； 12→13min， 100%B→10%B； 13→15min， 10%B。 5.根据权利要求1所述的测量方法， 其特征在于： 所述步骤 （2） 中， 所述检测中采用的质 谱条件如下： 所述质谱仪为AB  SCIEX 5500三重四级杆质谱仪， 离子化方式为正离子模式， 雾化气、 辅助加热气、 气帘气和碰撞气均为氮气， 压力分别为  75psi， 75psi， 30psi， M edium， 喷雾电压为4000V， 去溶剂温度为500℃； 以多反应监测模式扫描分析， 去簇电压、 入口电压， 碰撞能量， 碰撞室出口电压的参数如下 所示：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115236245 A 2。 6.根据权利要求1 ‑5中任一项所述的测量方法， 其特征在于： 所述步骤(2)还包括建立 同型半胱氨酸标准曲线的步骤， 具体方法如下： a1)标准溶 液配制 用同型半胱氨酸标准品配制成一系列浓度的标准溶 液； b1)分别等量称取每个浓度的标准溶液， 按照权利要求1中步骤 （2） 所述的血清样本前 处理的方法进 行处理， 并对处理后得到的标准溶液采用所述的高效液相色谱质谱法进 行检 测， 同时记录峰面积， 以同型半胱氨酸与同位素氘标记的同型半胱氨酸峰面积比值为纵坐 标， 以对应的同型半胱氨酸的浓度为横坐标， 建立标准曲线， 得到同型半胱氨酸的回归方 程。 7.根据权利要求6所述的测量方法， 其特征在于： 所述方法还进一步包括： 对所述步骤 (2)中对所述处理后的血清样本采用高效液相色谱质谱法进行检测， 将得到的同型半胱氨 酸与同位素氘标记的同型半胱氨酸峰面积比值代入所述标准曲线， 得到所述待测血清样本 中同型半胱氨酸的浓度。 8.一种同型半胱氨酸候选标准物质， 含同型半胱氨酸的混合人血清基质， 为如下5种 浓 度的同型半胱氨酸候选标准物质： （8.58 ±0.16） μmol/L、 （13.80 ±0.23） μmol/L、 （16.30 ± 0.32） μmo l/L、 （26.38 ±0.80） μmo l/L、 （54.3 5±1.66） μmol/L。 9.权利要求8所述同型半胱氨酸 候选标准物质的制备 方法， 包括下述 步骤： 收集不同个体的同型半胱氨酸含量为低、 中、 高5个不同浓度水平 的血清， 再分别对所 述5个不同浓度水平的血清中的血清同型半胱氨 酸浓度进行定值， 得到如下5种浓度的同型 半胱氨酸候选标准物质： （8.58 ±0.16） μmol/L、 （13.80 ±0.23） μmol/L、 （16.30 ±0.32） μ mol/L、 （26.38 ±0.80） μmo l/L、 （54.3 5±1.66） μmol/L。 10.根据权利要求9所述的制备方法， 其特征在于： 所述定值的方法为权利要求1 ‑8中任 一项所述的血清同型半胱氨酸的测量方法。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115236245 A 3