(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211107463.9 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 贵州医科 大学 地址 550000 贵州省贵阳市花溪区花溪大 学城栋青路2号 (72)发明人 黄勇　郑林　陆苑　蒙文莎　 巩仔鹏　李月婷　杨畅　王朴　 (74)专利代理 机构 昆明润勤同创知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 53205 专利代理师 付石健 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/04(2006.01) G01N 30/06(2006.01)G01N 30/72(2006.01) G01N 30/88(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种血浆中原苏木 素B-3-O-β-D-葡萄糖苷 及其代谢物的定性定量分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种血浆中原苏木素B ‑3‑O‑ β‑D‑葡萄糖苷及其代谢物的定性定量分析方 法， 采用UHPLC/QExactivePlusMS分析技术结合 CompoundDiscoverer3.2数据分析平台快速分析 大鼠血浆中原苏木 素B‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其 代谢物。 该方法的优点是： 简单、 快速和灵敏。 权利要求书2页 说明书10页 附图4页 CN 115267012 A 2022.11.01 CN 115267012 A 1.一种血浆中原苏木素B ‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其代谢物的定性定量分析方法， 其特征 在于： 包括以下步骤： 采用UHPLC/Q  Exactive  Plus MS分析技术结合CompoundDiscoverer  3.2数据分析平 台快速分析大鼠血浆中原苏木素B ‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其代谢物； 所述代谢物包括M1、 M2、 M3、 M4。 2.根据权利 要求1所述的一种血浆中原苏木素B ‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其代谢物的定性 定量分析方法， 其特征在于： 所述UHPLC/Q  Exactive Plus MS分析技术的条件包括色谱条 件和质谱条件； 所述色谱条件 包括： LC系统： Vanquish  horizon； 色谱柱： Hypersil  gold； 柱温： 35℃； 进样体积： 2 μL； 流速： 0.30mL/min； 流动相组成： B相： 0.1％甲酸 ‑水， A相： 0.1％甲酸 ‑乙腈， 洗脱梯度设置如下： 0 ‑ 2min， 5％A； 2 ‑3min， 5～25％A； 3 ‑6min， 25～40％A； 6 ‑13min， 40～95％A； 13 ‑14min， 95～ 95％A； 14 ‑5min， 95～5％A； 15 ‑18min， 5～5％A； 所述质谱条件包括： MS系统： Orbitrap  Exploris  240； 扫描范围:150 ‑1000m/z； 电喷雾 电压： 2.5kV( ‑)， 3.5kV(+)； 去溶剂气流速： 8L/min， 去溶剂气温度： 320℃； 使用Xcalibur   4.2和CompoundDiscoverer  3.2软件进行采集和处 理。 3.根据权利 要求1所述的一种血浆中原苏木素B ‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其代谢物的定性 定量分析方法， 其特征在于： 包括样品前处理； 所述样品前处理包括代谢产物研究、 药动学 研究、 对照品和QC样品的制备； 所述代谢产物研究包括以下步骤： 取大鼠血浆600 μL置于5mL离心管中， 依次加入2％甲 酸水溶液300 μL， 甲醇溶液2.4 mL， 涡混2min， 超声10min， 低温12 000rpm离心10min， 取上清液 置离心管中， 37℃氮气吹干， 残留物加入50％甲醇200μL复溶， 涡混2min， 超声10min， 低温 12000rpm离心10mi n， 取上清液进QE 仪器分析； 所述药动学研究包括以下步骤： 取大鼠血浆100μL， 置于1.5mL离心管中， 加入2％甲酸 水50μL， 涡混30s， 加入50μL葛根素内标， 加入甲醇400μL， 涡混2min， 超声10min， 低温 12000rpm离心10min， 取上清液置离心管中， 37℃氮气吹干， 残留物加入50％甲醇200μL复 溶， 涡混2mi n， 超声10mi n， 低温120 00rpm离心10mi n， 取上清液进行UPLC ‑MS/MS分析； 所述对照品和QC样品 的制备方法包括以下步骤： 分别称取适量的PTD、 PTB和IS， 放置于 10mL棕色容量瓶中， 加入少量甲醇超声溶解并定容， 获得PTD、 PTB、 IS的储 备液； 用甲醇稀释 储备液， 获得4套工作标准溶液； 取适量的内标储 备液至100mL容量瓶中， 用50％甲醇定容至 刻度， 配制成20ng/mL的内标溶液， 在 ‑20℃条件下置冰箱保存， 备用； 将工作标准溶液和IS 溶液的混合物添加到空白大鼠血浆中， 以制备PTD、 PTB和IS的最终浓度范围分别为1 ‑ 30000、 1‑1000和4ng/ml的校准标准溶 液； 以相同方式制备含有PTD和PTB的QC血浆样品。 4.根据权利 要求3所述的一种血浆中原苏木素B ‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷及其代谢物的定性 定量分析方法， 其特征在于： 还包括动物研究； 所述动物研究中选用的动物为SPF级SD大鼠， 雌雄各半， 体重为230 ±10g； 所述SD大鼠的饲养条件为： 动物房照明充足， 空调通风良好， 相 对湿度50 ±10％， 室温22 ±2℃， 定期对实验室进行消毒， 以普通颗粒大鼠饲料饮食， 分笼饲 养， 自由饮水； 还包括代谢产物研究； 所述代谢产物研究的步骤如下： 将健康SD大鼠， 随机分为给药组权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115267012 A 2和空白组， 每组6只； 给药组连续灌胃PTD  27.3mg/kg3天， 每天2次， 于末次给药后2h股动脉 取血， 4℃下6 000rpm离心6mi n， 分离10 0 μL血浆于 ‑20℃冰冻保存直至分析； 还包括药动学实验； 将健康SD大鼠随机分为两组， 每组6只； 灌胃组： 给药剂量27.3mg/ kg， 静脉注射组： 给药剂量9.1mg/kg， 分别于给药后0.083、 0.16 7、 0.33、 0.5、 0.75、 1、 1.5、 2、 4、 6、 9、 12和24h尾静脉取血0.3mL， 置有 肝素的离心管中； 4℃下6000rpm离心 6min， 分离100 μ L血浆于‑20℃冰冻保存直至分析。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115267012 A 3