(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211168048.4 (22)申请日 2022.09.23 (71)申请人 东南大学 地址 210096 江苏省南京市玄武区新 街口 街道四牌楼 2号 (72)发明人 高山　韩晓琦　 (74)专利代理 机构 北京同辉知识产权代理事务 所(普通合伙) 11357 专利代理师 沈利芳 (51)Int.Cl. G01N 33/574(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12Q 1/6886(2018.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种结肠癌标志 物及其应用 (57)摘要 本发明公开一种结肠癌标志物， 标志物利用 CRISPR‑Cas9基因编辑技术对SW480细胞系稳定 敲除了内源 性HUNK， 后经DNA测序和western技术 验证， 显微镜观察发现SW480细胞形态 由上皮转 变为间质形态， 分别使用瞬时转染siRNA及慢病 毒， 敲低和过表达HUNK， 使用细胞体外转移技术 Transwell， 发现HUNK表达水平下调， 促进结肠癌 细胞的上皮间质转化EMT， 过表 达HUNK的SW480细 胞则相反。 通过 实验发现敲除HUNK促进结肠癌细 胞的体内转移， 采用HUNK抑制剂STS处理野生型 SW480细胞， 与HUNK缺失的表型一致， 利用GEO数 据集GSE131418 进行生物学分析显示结肠癌患者 低表达HU NK与结肠癌远端 转移相关， 揭示HU NK参 与结直肠癌EMT进而促进结直肠癌转移的分子机 制， 最终为转移性结肠癌的治疗提供新的诊断及 治疗靶点。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115436635 A 2022.12.06 CN 115436635 A 1.一种结肠癌诊断的试剂盒， 其特 征在于， 包括用于检测HUNK表达水平的试剂。 2.根据权利要求1所述的一种结肠癌试剂 盒， 其特征在于， 所述包括用于检测抑制结肠 癌细胞的体内转移能力的CTG试剂盒。 3.根据权利要求1所述的一种结肠癌试剂盒， 其特征在于， 所述CTG试剂盒是对HUNK蛋 白水平与GEF ‑H1第645位丝氨酸磷酸 化的表达 。 4.根据权利要求1所述的一种结肠癌试剂 盒， 其特征在于， 所述标志物HUNK用于抑制结 肠癌细胞的体内转移能力。 5.根据权利要求1 ‑4任意一项所述的一种结肠癌标志物， 其特征在于， 所述标志物检测 方法包括： 1)针对HUNK对癌症转移E MT的抑制作用； 2)HUNK介导结肠癌E MT的信号 通路； 3)HUNK的临床信息分析。 6.根据权利要求5所述的一种结肠癌标志物， 其特征在于， 所述UNK针对抑制结肠癌细 胞转移的方法包括以下步骤： S1： 构建HUNK敲除细胞系 构建到sgRNA与CRISPR ‑Cas9蛋白的共同表达载体， 使用电转技术将表达载体转染 SW480细胞系， 筛选转染成功的阳性细胞， 提取基因组DNA， 并通过对第一外显子进行P CR， 对 产物测序进行测序， 对比HUNK基因片段， 检测其是否存在缺失突变， 并通过western验证敲 除是否成功； S2:构建HUNK 过表达及敲减细胞系 针对HUNK基因全长编码区的引物， 将HUNK全长基因通过PCR扩增， 构建HUNK过表达载 体， 通过HEK293T细胞包装相应的慢病毒， 过表达的慢病毒感染结肠癌SW480细胞及RKO细 胞， 针对HUNK基因设计siRNA， 通过瞬时转染方法， 对结肠癌SW480细胞及 RKO细胞的HUNK进 行敲减； S3： HUNK对E MT的作用研究 对HUNK敲减、 敲除和过表达细 胞系与各自的对照细 胞系进行transwel  l迁移及侵袭实 验， 通过western技术分别检测EMT的标志分子上皮标志物E ‑cadherin和间质标志物 Vimentin蛋白的表达量。 7.根据权利要求6所述的一种结肠癌标志物， 其特征在于， 所述HUNK介导结肠癌EMT 的 信号通路包括以下步骤： S1： 对HUNK敲除细胞系与对照细胞系的差异基因进行GSEA通路富 集； S2:通过蛋白数据库匹配分析找出HUNK潜在的结合蛋白； S3： 探索HUNK 下游的磷酸 化蛋白。 8.一种用于治疗结肠癌的药物， 包括用于抑制HUNK表达的成分。 9.根据权利要求8所述的药物， 其特 征在于， 所述成分为能够敲减HUNK的siRNA。 10.HUNK抑制剂在制备 结肠癌治疗药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115436635 A 2一种结肠癌标志物及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及临床诊疗领域， 具体是一种结肠癌标志 物及其应用。 背景技术 [0002]结肠癌是一个主要的公共卫生问题， 其属于异质性疾病， 不同的亚型对预后和治 疗反应也不相同， 根据不同结肠癌亚型的分类方案对于基础研究和临床结果具有重要意 义。 随着对结肠癌的病理生理学的深入认识增加了患者的治疗选择， 如： 内窥镜手术切除， 放射治疗， 免疫治疗， 姑息化疗， 靶向治疗， 局部消融治疗， 以上治疗方法有效地抑制了癌症 的进展并延长了患者总体生存期。 同时进行结肠癌大规模筛查， 如大便潜血试验和内窥镜 检查， 也极大地 提高了总生存率， 治愈率 也有很大提升 。 [0003]其中转移是结肠癌患者死亡的主要原因之一， 结肠癌早期患者通常无任何症状， 当出现直肠出血、 或腹痛等症状时， 大多数患者已处于恶性、 转移性癌症晚期。 结肠癌晚期 的诊断是决定患者生存差异和死亡的关键因素之一。 一些高度发达的国家已经实施人口普 筛方案， 对患者早发现早治疗。 近年来， 通过对驱动结肠癌恶化的分子机制进行探索， 出现 了相关的靶向治疗， 但临床效果 仍然较差 。 [0004]因此， 临床上迫切需要进行癌症侵袭转移过程中的分子通路研究， 以鉴定和验证 其中的新型生物标志物， 改善结肠癌患者的预后。 随着靶向治疗和免疫疗法在癌症治疗中 的重要性的增长， 探索可用于筛选高危患者， 特别是致死性较高的转移性患者靶向治疗和 免疫疗法疗效的新 生物标志 物变得尤为重要。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种结肠癌标志物及其应用， 基于转移性结肠癌在结肠癌 治疗中的重要性， 挖掘转移 性结肠癌发生的分子机制， 采用多种技术手段， 从分子、 细胞、 动 物及生物信息学等层面揭示HUNK参与结肠癌EMT进而促进结肠癌转移的分子机制， 最终为 转移性结肠癌的治疗提供新的诊断及治疗 靶点。 [0006]本发明的目的可以通过以下技 术方案实现： [0007]一种结肠癌标志 物， 所述标志 物为HUNK。 [0008]进一步的， 所述用于改善结肠癌的预后判断。 [0009]进一步的， 所述标志 物用于转移性结肠癌发生的分子 机制。 [0010]进一步的， 所述标志 物HUNK用于抑制结肠癌细胞的体内转移能力。 [0011]进一步的， 所述标志 物检测方法包括： [0012]1)针对HUNK对癌症转移E MT的抑制作用。 [0013]2)HUNK介导结肠癌E MT的信号 通路。 [0014]3)HUNK的临床信息分析。 [0015]进一步的， 所述HUNK对癌症转移E MT的抑制作用包括以下步骤： [0016]S1： 构建HUNK敲除细胞系。说　明　书 1/4 页 3 CN 115436635 A 3