(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211497301.0 (22)申请日 2022.11.28 (71)申请人 山东省食品药品检验研究院 地址 250000 山东省济南市高新区新 泺大 街2749号 (72)发明人 张迅杰　石峰　巩丽萍　咸瑞卿　 贺美莲　李春焕　由鹏飞　王聪聪　 (74)专利代理 机构 北京元本知识产权代理事务 所(普通合伙) 11308 专利代理师 徐苹 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) (54)发明名称 一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方 法 (57)摘要 本发明涉及药物分析技术领域， 尤其涉及一 种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法。 所述 血浆中阿普斯特浓度的检测方法， 包括以下步 骤： 将含阿普斯特的血浆、 阿普斯特 ‑d5的乙腈溶 液混合进行沉淀反应， 将所得上清液分别注入液 相色谱‑质谱仪， 进行多反应监测反应， 用内标法 以标准曲线计算血浆中阿普斯特的含量， 所述标 准曲线以阿普斯特的浓度为横坐标， 以阿普斯特 和阿普斯特 ‑d5的峰面积比值为纵坐标。 本发明 基于沉淀法和液质联用技术进行血浆中阿普斯 特的检测， 可用于检测生物体内的阿普斯特浓 度， 提供了一种快速、 准确、 稳定的检测方法。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 115541778 A 2022.12.30 CN 115541778 A 1.一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将含阿普斯特的血浆、 阿普斯特 ‑d5的乙腈溶液混合进行沉淀反应， 将所得上清液分别 注入液相色谱 ‑质谱仪， 进行多反应监测反应， 用内标法以标准曲线计算血浆中阿普斯特的 含量， 所述标准曲线以阿普斯特的浓度为横坐标， 以阿普斯特和阿普斯特 ‑d5的峰面积比值 为纵坐标。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述多反应监测反应中， 所述阿普斯 特的定量离 子对为461.2→257.1， 所述阿普斯特 ‑d5的离子对为466.1→262.3。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述液相色谱 ‑质谱仪中液相条件为： 色谱柱为Phenomenex  Kinetex C18 (2.1×50 mm， 2.6  µm)色谱柱， 流动相A为含0.1%甲酸 的水溶液， 流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液， 采用梯度洗脱， 洗脱程序为洗脱程序为： 0~0.5  min， 流动相A的体积百分含量保持63%， 流动相B的体积含量保持37%； 0.5~1.3 min， 流动相A 的体积百分含量从63%下降到0.0%， 流动相B的体积百分含量从37%上升到100%； 1.3~2.4  min， 流动相A的体积百分含量保持0.0%， 流动相B的体积含量保持100%； 2.4~2.41 min， 流动 相A的体积百分含量从0.0%上升到63%， 流动相B的体积百分含量从100%下降到37%； 2.41~ 3.0 min， 流动相A的体积百分含量保持63%， 流动相B的体积含量保持37%， 流速为0.45  mL/ min， 柱温为 40℃， 进样量 为5  µL。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述液相色谱 ‑质谱仪中质谱条件为： 使用三重四级杆质谱仪， 离子源为电喷雾离子源， 采用负 离子模式， 采用多反应监测扫描模 式， 离子化电压： 5500  V ； 入口电压： 10  V； 碰撞室出口电压： 13  V； 喷雾气： 50； 辅助加热气： 55； 气帘气： 3 5， 碰撞能量： 14  V， 去簇电压： 190  V。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述混合进行沉淀反应的具体操作 为： 将含阿普斯特的血浆、 阿普斯特 ‑d5的乙腈溶液混合， 涡旋混合5  min， 置4℃台式高速 冷 冻离心机中， 4750  r/min离心10  min， 每孔取上清100   µL， 转移至另一9 6孔板， 每孔加10%乙 腈水溶液100  µL稀释， 涡旋混合5  min后， 注入液相色谱 ‑质谱仪进行 液质联用检测。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述标准曲线由包括以下步骤的方法 制得： 称量1  mg阿普斯特， 用N， N ‑二甲基甲酰胺溶解得到1  mg/mL的阿普斯特母液， 用50%乙 腈水溶液稀释 至质量浓度为 100 ng/mL阿普斯特工作溶液， 用50%乙腈水溶液将所述工作溶 液稀释成40、 80、 200、 600， 2000， 4000， 9600和12000  ng/mL的标准曲线工作液， 取空白血浆 285  µL， 加入不同浓度的标准曲线工作液15   µL， 得到2.0， 4.0， 10.0， 30.0， 100.0， 200.0， 480.0和600.0  ng/mL的标准曲线样品， 取所述标准曲线样品100   µL， 加400  µL阿普斯特 ‑d5 的乙腈溶液进行沉淀反应， 涡旋混合5  min， 置4℃台式高速 冷冻离心机中， 4750  r/min离心 10 min， 每孔取上清100   µL， 转移至另一96孔板， 每孔加10%乙腈水溶液100   µL稀释， 涡旋混 合5 min进行液质联用检测， 使用内标法对所得数据进行处理， 以阿普斯特的浓度为横坐 标， 阿普斯特和阿普斯特 ‑d5的峰面积比值为纵坐标， 以1/x2为权重系数， 利用加权最小二 乘法进行线性回归， 得到所述标准曲线。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述阿普斯特 ‑d5的乙腈溶液的配制 方法为： 称量1  mg阿普斯特 ‑d5标准品， 用N， N ‑二甲基甲酰胺溶解， 配成1  mg/mL的内标母 液， 用乙腈溶 液进一步将内标母液稀释为浓度为20.0  ng/mL阿普斯特 ‑d5的乙腈溶 液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541778 A 2一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及药物分析技 术领域， 尤其涉及一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法。 背景技术 [0002]阿普斯特是一种口服的环单磷酸腺苷 （cAMP） 特异性磷酸二酯酶 ‑4 （PDE4） 小分子 抑制剂。 PDE4的抑制能够升高细胞内的cAMP水平， PDE4降解cAMP可导致免疫细胞激活和促 炎细胞因子释放。 因此抑制PDE4可能能够降低 PDE4介导的炎症反应。 阿普斯特片， 2014年03 月21日在美国获批上市销售， 批准的适应症为活动性银屑病关节炎， 适用光疗或者系统治 疗的中度至重度斑块状银屑病和与白塞病相关的口腔溃疡。 2014年9月， FDA  批准阿普斯特 用于治疗中重度斑块状银屑 病。 由于其有希望的治疗结果和安全性， 该药物分子在皮肤病 学中变得非常流行。 据研究报道， 目前国内有关测定人体内阿普斯特血药浓度的方法尚未 研究， 而测定其在生物体内的血浆药物浓度对于评价药物疗效和分析药理作用等方面具有 很重要的作用， 因此开发一种测定血浆中阿普斯特浓度的检测方法， 进行阿普斯特在中国 健康受试者空腹及餐后状态下体内的药动学及人体生物等效性研究， 不仅可以为阿普斯特 相关制剂一 致性评价提供依据， 而且具有广泛的经济效益和社会效益。 发明内容 [0003]为解决现有技术存在的技术问题， 本发明的目的在于提供一种血浆中阿普斯特浓 度的检测方法。 本发明基于沉淀法和液质联用技术进行血浆中阿普斯特 的检测， 可用于检 测生物体内的阿普斯特浓度， 提供了一种快速、 准确、 稳定的检测方法。 [0004]为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技 术方案： 本发明提供了一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法， 包括以下步骤： 将含阿普斯特的血浆、 阿普斯特 ‑d5的乙腈溶液混合进行沉淀反应， 涡旋混合5   min， 置4 ℃台式高速冷冻离心 机 （96孔板） 中， 4750  r/min离心10  min， 每孔取上清100   µL， 转移至另一96孔板， 每孔加10%乙腈水溶液100   µL稀释， 涡旋混合5  min后， 进行液质联用检 测， 用内标法以标准 曲线计算血浆中阿普斯特 的含量， 所述标准 曲线以阿普斯特 的浓度为 横坐标， 以阿普斯特和阿普斯特 ‑d5的峰面积比值 为纵坐标。 [0005]进一步地， 所述液质联用检测的高效液相色谱条件包括： 色谱柱为Phenomenex   Kinetex C18 (2.1×50 mm， 2.6  µm)色谱柱， 采用梯度洗脱， 流动相A为含0.1%甲酸的水溶 液， 流动相B为0.1  %甲酸乙腈溶液， 洗脱程序为0~0.5 min， 流动相A 的体积百分含量保持 63%， 流动相B的体积含量保持37%； 0.5~1.3 min， 流动相A的体积百分含量从63%下降到 0.0%， 流动相B的体积百分含量从37%上升到100%； 1.3~2.4 min， 流动相A的体积百分含量保 持0.0%， 流动相B的体积 含量保持100%； 2.4~2.41 min， 流动相A的体积百分含量从0.0%上升 到63%， 流动相B的体积百分含量从100%下降到37%； 2.41~3 min， 流动相A的体积百分含量保 持63%， 流动相B的体积含量保持