(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211158404.4 (22)申请日 2022.09.22 (71)申请人 河南羚锐制药股份有限公司 地址 465550 河南省信阳市新县将军路6 66 号 (72)发明人 熊伟　李磊　卢玉斌　郭立　何梅　 高琴　左杰　张春霞　 (74)专利代理 机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 专利代理师 蔡文雅 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/88(2006.01) (54)发明名称 一种活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建 立方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及活血消痛酊挥发性成分特征图 谱的建立方法及其应用， 可全面地对活血消痛酊 中挥发油的整体质量进行评价， 并对活血消痛酊 中各单味药材色谱峰进行了归属确证， 保证活血 消痛酊中有效成分的种类相对 稳定， 其解决的技 术方案是， 包括以下步骤： 1） 供试品溶液的制备； 2） 对照品溶液的制备； 3） 特征图谱建立与相似度 计算； 4） 确定活血消痛酊挥发性成分与药材、 原 料的相关性； 本发明经方法学验证其精密度、 重 复性及稳定性好， 简便、 可行， 能快速测定不同指 标成分， 准确度高， 能更好的评价活血消痛酊的 质量， 是活血消痛酊挥发性 成分特征图谱建立方 法上的创新。 权利要求书2页 说明书24页 附图7页 CN 115508471 A 2022.12.23 CN 115508471 A 1.一种活血消痛酊挥发性成分特 征图谱的建立方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1） 供试品溶液的制备： 取活血消痛酊样品， 置烧瓶中， 加入蒸馏水及沸石， 利用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 挥 发油测定器中加入提取溶剂， 提取后冷却至室温， 收集提取溶剂层， 用无水硫酸钠脱水， 并 用提取溶剂清洗冷凝管、 挥发油提取器， 定容， 摇匀， 得活血消痛酊挥发性成分供 试品溶液；  2） 对照品溶 液的制备： 取3‑蒈烯、 桉油精、 樟脑、 反式石竹烯、 薄荷脑、 异龙脑、 龙脑、 丁香酚、 对 甲氧基肉桂酸 乙酯对照品， 用提取 溶剂溶解并定容， 配成一定浓度溶 液， 即得对照品溶 液； 3） 特征图谱建立与相似度计算： 分别吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品溶液， 注入气质色谱仪， 以薄荷 脑为特征图谱参照物， 以薄荷脑色谱 峰为参照物峰， 测定多批活血消痛酊挥发性成分供试 品溶液， 生成活血消痛酊挥发性成分共有对照特征图谱， 以图谱中均存在的色谱 峰作为共 有特征峰， 确定共有特征峰的相对保留时间， 得到由其共有特征峰构成的活血消痛酊挥发 性成分的GC ‑MS标准对照特征图谱； 将共有对照特征图谱与构建的标准对照特征图谱， 利用 共有峰进行相似度计算； 4） )确定活血消痛酊挥发性成分与药 材、 原料的相关性： 根据步骤1） 活血消痛酊样品取样量， 取与处方中等生药量的各单独药材和原料用量， 并按照步骤1） 方法制备当归、 川芎、 花椒、 胡椒、 丁香、 肉桂、 荜茇、 干姜、 山奈、 红花、 大黄11 味单味药材和樟脑、 冰片、 薄荷脑原料的供试品溶液； 分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试 品溶液、 各单独药材和原料供试品溶液， 采用步骤3） 特征图谱建立方法， 将活血消痛酊挥发 性成分的特征图谱与当归、 川芎、 花椒、 胡椒、 丁香、 肉桂、 荜茇、 干姜、 山奈、 红花、 大黄11味 单味药材和樟脑、 冰片、 薄荷脑原料的GC ‑MS特征图谱进行比较， 对比各色谱峰的相 对保留 时间， 确定共有峰主 要来源。 2.根据权利要求1所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法， 其特征在于， 所 述的步骤1） 、 步骤2） 中， 提取 溶剂为石油醚、 二甲苯、 乙酸乙酯的一种。 3.根据权利要求1所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法， 其特征在于， 所 述的步骤3） 中， 气质色谱仪条件为： 以高纯氦为载气， 以PEG为固定相， 色谱柱为： Agilent   PEG20M毛细管色谱柱30m ×320 μm， 膜厚度0.25 μm， 气相条件为： 进样口温度为220 ‑240℃， 柱 流速为0.6 ‑1.2ml/min， 分流比为2～10:1； 质谱条件为： 电子轰击离子源； 电子能量70eV； 离 子源温度： 230℃； 接口温度： 220 ‑250℃； 四级杆 温度150 ℃； 质量扫描范围  m/z30‑600全扫 描； 溶质延迟4.6mi n； 后运行在23 0℃保持10mi n； 调谐文件为标准调谐。 4.根据权利要求1所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法， 其特征在于， 所 述的活血消痛酊挥发性成分 的GC‑MS标准对照特征图谱是由32个共有峰构成， 以对照品对 照， 2号峰为3 ‑蒈烯， 7号峰为桉油精， 17号峰为樟脑， 22号峰为反式石竹烯， 24号峰为薄荷 脑， 25号峰为异龙脑， 26号峰为龙脑， 30号峰为丁香酚， 32 号峰为对甲氧基肉桂酸乙酯， 以薄 荷脑为参照物， 24号峰为参照峰， 该标准对照特征图谱具有32个共有 特征峰， 与参照物峰相 应的峰为S峰， 计算各 特征峰与S峰的相对保留时间， 其相对保留时间在规定值的 ±1%之内。 5.根据权利要求4所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法， 其特征在于， 所 述的标准对照特征图谱相对保留时间规定值为1号峰0.2710， 2号峰0.3756， 3号峰0.3820， 4权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115508471 A 2号峰0.3884， 5号峰0.4001， 6号峰0.4158， 7号峰0.4244， 8号峰0.4382， 9号峰0.452 5， 10号峰 0.4733， 11号峰0.4827， 12号峰0.59 12， 13号峰0.6402， 14号峰0.6477， 15号峰0.6829， 16号 峰0.7235， 17号峰0.7799， 18号峰0.8206， 19号峰0.8322， 20号峰0.8595， 2 1号峰0.8756， 22 号峰0.8968， 23号峰0.9455， 24号峰1.0000， 25号峰1.0780， 26号峰1.1726， 27号峰1.1992， 28号峰1.215 5， 29号峰2.3 570， 30号峰2.4620， 31号峰3.4971， 32号峰3.5981。 6.根据权利要求1所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法， 其特征在于， 包 括以下步骤： 1） 供试品溶液的制备： 取1‑4mL活血消痛酊样品， 加入50 ‑150mL蒸馏水， 放入沸石5颗， 利用水蒸气蒸馏法提取 挥发油， 挥发油 测定器中加入1 ‑4mL提取溶剂， 提取时间3 ‑5h， 提取后冷却至室温， 收集乙酸 乙酯层， 用无水硫酸钠脱水， 并用乙酸乙酯清洗冷凝管、 挥发油提取器， 洗涤液与上述脱水 乙酸乙酯液合并， 加乙酸乙酯稀释定容至5 ‑20mL， 摇匀， 得活血消痛酊挥发性 成分供试品溶 液； 2） 对照品溶 液的制备： 取3‑蒈烯、 桉油精、 樟脑、 反式石竹烯、 薄荷脑、 异龙脑、 龙脑、 丁香酚、 对 甲氧基肉桂酸 乙酯对照品， 加乙酸乙酯， 分别配成浓度为5～10 μg/ml、 5～10 μg/ml、 30～50 μg/ml、 5～10 μ g/ml、 10～ 30 μg/ml、 10～2 0 μg/ml、 10～20 μg/ml、 5～10 μg/ml、 5～10 μg/ml的溶液， 即得对照 品溶液； 3） 特征图谱建立与相似度计算： 分别吸取对照品溶液与活血消痛酊挥发性成分供试品溶液各1 ‑4ul， 注入气质色谱仪， 以薄荷脑为特征图谱参照物， 以薄荷脑色谱 峰为参照物峰， 测定20批活血消痛酊挥发性成 分供试品溶液， 记录8 0分钟色谱图， 生 成活血消痛酊挥发性 成分共有对照特征图谱， 以图谱 中均存在的色谱 峰作为共有特征峰， 确定共有特征峰的相对保留时间， 得到由其共有特征 峰构成的活血消痛酊挥发性成分的GC ‑MS标准对照特征图谱； 将共有对照特征图谱与构建 的标准对照特 征图谱， 利用共有峰进行相似度计算； 4） 确定活血消痛酊挥发性成分与药 材、 原料的相关性： 根据步骤1） 活血消痛酊样品取样量， 取与处方中等生药量的各单独药材和原料用量， 并按照步骤1） 方法制备当归、 川芎、 花椒、 胡椒、 丁香、 肉桂、 荜茇、 干姜、 山奈、 红花、 大黄11 味单味药材和樟脑、 冰片、 薄荷脑原料的供试品溶液； 分别吸取活血消痛酊挥发性成分供试 品溶液、 各单独药材和原料供试品溶液， 采用步骤3） 特征图谱建立方法， 将活血消痛酊挥发 性成分的特征图谱与当归、 川芎、 花椒、 胡椒、 丁香、 肉桂、 荜茇、 干姜、 山奈、 红花、 大黄11味 单味药材和樟脑、 冰片、 薄荷脑原料的GC ‑MS特征图谱进行比较， 对比各色谱峰的相 对保留 时间， 确定共有峰主 要来源。 7.权利要求1 ‑6任一项所述的活血消痛酊挥发性成分特征图谱的建立方法在活血消 痛 酊药品质量标准与质量控制中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115508471 A 3