(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211129232.8 (22)申请日 2022.09.16 (71)申请人 杭州市食品药品检验研究院 （杭州 市食品药品审核查验服 务中心、 杭 州市药品与医疗器 械不良反应监测 中心） 地址 310022 浙江省杭州市下城区石桥路 永华街198号洄龙湖邸1、 2、 3幢 (72)发明人 张伟　杨直　沈国芳　施思　 刘宇文　申屠银洪 　寿璐佳　 (74)专利代理 机构 杭州恒翌专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33298 专利代理师 柯奇君 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01) G01N 30/08(2006.01) G01N 30/14(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/36(2006.01) G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯 酮和赭曲霉毒素A的方法 (57)摘要 本发明涉及食品药品中真菌毒素的检测方 法， 尤其涉及一种免疫亲和柱净化 ‑柱后光化学 衍生‑高效液相色谱法同时检测六神曲中黄曲霉 毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法。 该方 法用XBridge ®Phenyl柱子以乙腈为流动相A， 0.2%醋酸溶液为流动相B， 梯度洗脱， 流速:1mL/ min， 柱温:35℃； 可变荧光检测波长:0～20min, 激发波长365nm,发射波长450nm （检测黄曲霉毒 素G2,G1,B2,B1）； 20.01～25min,激发波长 274nm,发射波长460nm(检测玉米赤霉烯酮）； 25.01～25min,激发波长333nm,发射波长460nm (检测赭曲霉毒素A） 。 该方法简便、 快速、 净化效 果好,各项技术指标均符合真菌毒素检测的求, 可以满足1次进样可同时测定六神曲中黄曲霉毒 素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的限量检测要 求。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 115452990 A 2022.12.09 CN 115452990 A 1.一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的方法， 黄曲霉毒 素为黄曲霉毒素B1、 B2、 G1和G2； 其特 征在于， 该 方法包括以下的步骤： 1)样品提取 精密称定供试品5g， 精密加入80％体积百分比浓度甲醇50ml， 超声40min， 转移至50ml 离心管中， 6000转离心10min； 精密量取上清液10ml置50ml量瓶中用水稀释至刻度， 摇匀， 6000转离心10min， 量取上清液25ml通过免疫亲和柱进行洗脱， 洗脱完成后加入20ml水进行 再次洗脱， 弃去洗脱液， 将柱子中的水挤出， 再加2ml的 甲醇洗脱， 收集洗脱液， 摇匀； 2)高效液相色谱法测定 测定设备采用岛津高效液相色谱仪和德国LC ‑Tech公司生产光化学衍生仪， 用 Phenyl苯基柱以乙腈为流动相A， 0.1％体积百 分比浓度醋酸 溶液为流动相B， 梯度 洗脱， 流速:1mL/mi n， 柱温:3 5℃； 梯度洗脱如下： 检测黄曲霉毒素G2， G1， B2， B1： 0～20min,激发波长365nm,发射波长为450nm； 检测玉米 赤霉烯酮： 20.01～ 25min,激发波长274 nm,发射波长46 0nm； 检测赭曲霉毒素A： 25.01～ 25min,激发波长 333nm,发射波长46 0nm。 2.根据权利要求1所述的一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉 毒素A的方法， 其特 征在于， 该 方法还包括以下的步骤： 精密量取对照品适量， 加甲醇稀释得到， 对照品进样量为2、 5、 10、 15、 20 μl， 注入液相色 谱仪， 记录峰面积， 以各对照品浓度(X， μg ·mL)为横坐标， 峰面积 Y为纵坐标， 各成分回归方 程如下： 3.根据权利要求2所述的一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉 毒素A的方法， 其特征在于， 黄曲霉毒素对照品的制备方法如下： 对照品溶液批号610001 ‑权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115452990 A 2202107， 中检院,B1 1.08 μg/mL、 B2浓度0.33 μg/mL、 G1浓度1.01μg/mL、 G2浓度0.33 μg/mL， 精 密量取对照品溶液1ml置20ml量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 作为储备液； 精密量取储备液 0.4ml置10ml 量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 摇匀即得。 4.根据权利要求2所述的一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉 毒素A的方法， 其特征在于， 玉米赤霉烯酮对照品的制备方法如下： 对照品溶液批号610022 ‑ 202101， 中检院,10.1 μg/ml， 精密量取对照品溶液1ml置10ml量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 作 为储备液； 精密量取储备 液1ml置10ml 量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 摇匀即得。 5.根据权利要求2所述的一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉 毒素A的方法， 其特征在于， 赭曲霉毒素A对照品的制备方法如下： 对照品溶液批号2B00G12， 普瑞邦， 100.9 μg/ml,精密量取对照品溶液0.1ml置100ml量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 作为 储备液； 精密量取储备 液2.5ml置10 0ml量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 摇匀即得。 6.根据权利要求1所述的一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉 毒素A的方法， 其特 征在于， 该 方法还包括以下的步骤： 取对照品混标溶液一份， 分别于0、 4h、 8h、 12h、 16h、 20h、 24h进样,进样量为20μl， 分别 测定G2,G1,B2,B1,玉米赤霉烯酮， 赭曲霉毒素A的峰面积值并计算RS D， 结果如下： 成分 RSD％ G2 1.48 G1 0.85 B2 1.82 B1 2.38 玉米赤霉烯酮 3.19 赭曲霉毒素A 1.24 。 7.根据权利要求1所述的一种同时检测六神曲中黄曲霉毒素、 玉米赤霉烯酮和赭曲霉 毒素A的方法， 其特 征在于， 该 方法还包括以下的步骤： 取六神曲粉末5.0g， 共3份， 精密称定， 分别置500mL具塞锥形瓶中， 分别加入黄曲霉毒 素对照品储 备液0.8ml、 玉米赤霉烯酮对照品储 备液1ml、 赭曲霉毒素对照品0.2ml按权利要 求1所述的方法操作， 进样10 μL测定， 计算回收率， 结果G2,G1,B2,B1,玉米赤霉烯酮、 赭曲霉 毒素A的平均加样回收率(n＝6)分别为： 99.88％、 99.10％、 96.58％、 83.49％、 69.31％、 33.14％， RS D分别为1.75％、 1.17％、 1.0 6％、 1.74％、 9.98％、 12.73％。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115452990 A 3