(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211172580.3 (22)申请日 2022.09.26 (66)本国优先权数据 20221094376 0.0 2022.08.08 CN (71)申请人 杭州凯莱谱精准医疗检测技 术有限 公司 地址 310000 浙江省杭州市西湖区金 蓬街 321号2号楼 A座2楼 (72)发明人 张雪　孔子青　刘楚　喻艾萍　 刘华芬　 (74)专利代理 机构 杭州天昊专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33283 专利代理师 向庆宁 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01)G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/32(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种检测三 羧酸循环中有机酸的方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测三羧酸循环中有机 酸的方法， 所述方法使用衍生剂 对生物样本进行 衍生化并使用液相色谱 ‑质谱联用技术进行检 测； 所示衍生剂包括苯甲醇和三甲基氯硅烷。 通 过该方法能同时、 快速测定尿液、 血清/血浆、 头 发、 粪便、 唾液、 脑脊液、 卵泡液或组织等多种生 物样本中的参与三羧酸循环的7种有机酸。 该方 法的准确度和精密度高、 稳定性好， 对疾病诊断 或风险预测生物标志 物研发开发具有重要意 义。 权利要求书2页 说明书37页 附图14页 CN 115267014 A 2022.11.01 CN 115267014 A 1.一种检测三羧酸循环中有机酸的方法， 其特征在于， 所述方法使用衍生剂对生物样 本进行衍生化并使用液相色谱 ‑质谱联用技术进行检测； 所述衍生剂由苯 甲醇和三甲基氯 硅烷组成。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述衍生化的步骤包括： S1： 向生物液体样 本中直接加入内标溶液和苯甲醇， 再加入三甲基氯硅烷， 混匀； S2： 控温一段时间进行衍生 反应； 其中， 步骤S1 中生物样本、 内标溶液、 苯甲醇及三甲基氯硅烷的体积比为2： 2~5： 5~7： 3 ~5。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 步骤S1中生物样本、 内标溶液、 苯甲醇及三 甲基氯硅烷的体积比为2： 2： 5： 3 。 4.根据权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤S2中控制反应温度为60℃~80℃， 衍生 反应时间不低于75mi n。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述内标溶液中含有以下化合物： α ‑酮戊 二酸‑13C5、 琥珀酸‑d4、 富马酸‑13C4、 苹果酸‑d3、 柠檬酸‑d4。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述液相色谱的条件包括： 色谱柱为 Phenomenex Kinetex C18 Column， 2.6 μm， 100A， 3.0×50 mm； 柱温为 40℃； 进样量 为2~5 μL； 采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱， 流速为0.6  mL/min， 流动相A为0.1%甲酸 ‑2 mM 乙酸铵‑水溶液； 流动相B为乙腈； 梯度洗脱程序包括： 0至0.5min  40%流动相 A和60%流动相 B， 0.5min至2.2min  流动相A由40%至0%、 流动相B由60%至100%； 2.2min至3.2min  100%流动 相B； 3.2min至3.25min  流动相B由100%至60%、 流动相A由0%至40%； 3.25min至4.00min  40% 流动相A和6 0%流动相B。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述液相色谱的条件还包括： 强洗溶液为 甲醇； 弱洗溶 液为0.5%乙腈水 溶液。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述生物样本为尿液、 血清、 血浆、 头发中 的一种或多种。 9.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述有机酸由下列组成： 顺式乌头酸、 异柠 檬酸、 α‑酮戊二酸、 琥珀酸、 富马酸、 苹果 酸、 柠檬酸。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述方法的质谱条件包括： 采用电喷雾电 离源和正离子模式； 喷雾电压： 5500V； 温度： 350℃； 雾化气： 55psi； 辅助加热气： 55psi； 气帘 气： 25psi； 碰撞气： 6psi； 采用多反应监测扫描方式。 11.根据权利要求10所述的方法， 其特征在于， 采用多反应监测扫描方式对所述有机酸 进行定量和定性检测； 顺式乌头酸的定量离子对为445.2 →271.2， 定性离子对为445.2 → 265.2； α‑酮戊二酸的定量离子对为344.1 →147.1， 定性离子对为344.1 →101.1； 琥珀酸的 定量离子对为316.1 →101.1， 定性离子对为299.0 →101.1； 富马酸的定量离子对为314.0 → 181.1， 定性离子对为314.0 →91.1； 苹果酸的定量离子对为332.1 →89.0， 定性离子对为 315.1→135.1； 柠檬酸的定量离子对为463.1 →237.1， 定性离子对为463.1 →283.1； 异柠檬 酸的定量离 子对463.1→283.1， 定性离 子对为463.1→237.1。 12.一种试剂盒， 包括用于对液体样品中7种有机酸进行衍生的试剂， 所述的试剂由苯 甲醇和三甲基氯硅烷组成。 13.根据权利要求12所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还含有标准品溶液和内标权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115267014 A 2溶液； 所述标准品溶液含有顺式乌头酸、 异柠檬酸、 α ‑酮戊二酸、 琥珀酸、 富马酸、 苹 果酸、 柠 檬酸； 所述内标 溶液含有α‑酮戊二酸‑13C5、 琥珀酸‑d4、 富马酸‑13C4、 苹果酸‑d3、 柠檬酸‑d4。 14.衍生剂在用于制备检测液体样本中三羧酸循环中有机酸方面的用途， 其特征在于， 所述衍生剂由苯甲醇和三甲基氯硅烷组成； 所述有机酸为顺式乌头酸、 异柠檬酸、 α ‑酮戊二 酸、 琥珀酸、 富马酸、 苹果 酸、 柠檬酸。 15.根据权利要求14所述的用途， 所述的液体样本与苯甲醇、 三甲基氯硅烷之间的体积 比为2： 5： 3 。 16.根据权利要求15所述的用途， 其中， 当所述的液体样本为尿液的时候， 直接向尿液 中加入衍生试剂； 当液态样 本为血液的时候， 需要在衍生前对 血液样本进 行处理； 当样 本为 头发样本的时候， 需要对头发样品进行衍 生前的处 理步骤。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115267014 A 3