(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211352722.4 (22)申请日 2022.11.01 (71)申请人 常州百瑞吉生物医药有限公司 地址 213125 江苏省常州市新北区薛冶路 117号B座 (72)发明人 张红晨　谢健　蔡娜　谢惠芬　 王云云　舒晓正　 (74)专利代理 机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 3121 1 专利代理师 陈钧 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) (54)发明名称 一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇 残留的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种巯基化透明质 酸衍生物 中二硫苏糖醇残留的检测方法， 包括以下步骤： 配制DTT标准品工作液； D TT标准品经凝胶渗透色 谱检测获得对应的标准曲线； 配制待测样品工作 液； 待测样品工作液经凝胶渗透色谱检测， 获得 样品中二硫 苏糖醇的残留含量。 本发 明样品无需 处理， 操作方法简单易行， DTT在1～20  ppm范围 内有良好的线性范围 （其线性相关系数 （R2） 为 0.9994）， 最低检测限可达到1  ppm（信噪比 3.67） ， 定量限可达到2.72  ppm （信噪比10） ， 准确 度高 （回收率 （R） 在105.6%～111.9%之间 （RSD为 3%） ） ， 能够满足 实际检测中的需要。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 115389681 A 2022.11.25 CN 115389681 A 1.一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： 步骤 （1） 标准品工作液： 精密称取一定量的DTT标准品， 以pH  3.5～4.5的磷酸盐缓冲液 为稀释剂， 配制成不少于4个浓度梯度、 范围为1～ 20 ppm的DTT标准品工作液； 步骤 （2） 标准曲线： 步骤 （1） 的标准品工作液依次经凝胶渗透色谱检测， 分别获得对应 的二硫苏糖醇的峰面积， 并与标准品工作液 的浓度进行线性回归产生标准 曲线， 或由软件 系统自动生成标准曲线； 步骤 （3） 待测样品工作液： 精密称取一定量的巯基化透明质酸衍生物， 以pH  3.5～4.5 的磷酸盐缓冲液为稀释剂， 配制浓度范围为3～ 20 mg/ml巯基化透明质酸 衍生物溶液； 步骤 （4） 待测样品测定： 步骤 （3） 的待测样品工作液经凝胶渗透色谱检测， 获得样品的 二硫苏糖醇的峰面积， 代入至步骤 （2） 的标准曲线， 计算得到待测样品中二硫苏糖醇的残留 含量； 步骤 （2） 、 步骤 （4） 所述的凝胶渗透色谱检测采用的是Water  2695‑2998液相色谱仪； 水 相凝胶渗透色谱柱的型号是Ult rahydrogelTM 120， 7.8×300mm， 填料粒径 6µm； 柱温： 3 0℃。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述凝胶渗透色谱的进样量为10～ 100  µl； 流速为0.5～1.0  ml/min。 3.根据权利 要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述凝胶渗透色谱的流动相为pH  3.5 ～4.5的磷酸缓冲盐与乙腈的混合溶 液。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特征在于， 所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为 85:15～95:5。 5.根据权利要求2所述的检测方法， 其特 征在于， 所述 流速为0.7  ml/min。 6.根据权利要求2所述的检测方法， 其特 征在于， 所述进样量 为40µl。 7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述凝胶渗透色谱的检测器是光电二 极管阵列检测器。 8.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述凝胶渗透色谱的检测波长是 210nm。 9.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述标准品工作液的浓度梯度分别为 1、 2、 5、 10和20p pm。 10.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述巯基化透明质酸衍生物的分子 量大于120  KDa。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115389681 A 2一种巯基化透明质酸衍生物中 二硫苏糖醇残留 的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 二硫苏糖醇检测技术领域， 特别涉及 一种巯基化透明质酸衍生物中的 二硫苏糖醇残留的检测方法。 背景技术 [0002]透明质酸(Hyaluronic  Acid， 简称HA)， 又名 “玻璃酸”， 广泛分布于动物和人体的 细胞外基质中， 是细胞基质和多种组织的重要组成成分， 具有多种重要的生理学功能。 采用 含有二硫键的氨基试剂与透明质酸的侧链羧基进行偶联反应； 偶联反应结束后， 二硫键可 经简单的还原过程还原为自由巯基， 即可得到巯基化透明质酸衍生物， 这是当前巯基化透 明质酸衍生物最为常用的制备方法； 在上述二硫键还原为自由巯基的过程中， 目前最为广 泛使用的还原剂是二硫苏糖醇。 [0003]二硫苏糖醇(Dithiothreitol， 简称为DTT)是一种小分子有机还原剂， 化学式为 C4H10O2S2。 其还原状态下为线性分子， 被氧化后变 为包含二硫 键的六元环状结构。 DTT可以将 巯基保持在还原态， 常用于还原蛋白分子和多肽的二硫键， 更普遍用以防止蛋白半胱氨酸 残基形成分子内和分子间的二硫键， 通常作为蛋白质巯基保护剂 。 DTT进入体内可能会破坏 蛋白质结构， 从而引起酶失活等现象， DTT的残余可能导致潜在的安全性隐患， 因此需要严 格监控过程中样品以及终产品中的还原剂 DTT的残留量。 [0004]根据目前报道， 采用传统分光光度计法进行测定时， DTT极容易被氧化， 响应不稳 定， 灵敏度低， 不能满足检测要求。 还有一种基于液相色谱的测试方法是用单溴二胺(mBBr) 这种荧光探针对DTT进行衍生， 衍生后利用反相液相色谱和荧光检测器对DTT进行定量分 析， 这种方法灵敏度高， 但是样品前处理过程复杂， 对反应环境要求严格， 不适用于工业生 产过程中对DTT残留量的检测。 中国专利CN112526028A公开了采用液相色谱串级质谱 （LC ‑ MS/MS） 法同时对二硫 苏糖醇还原态和氧化态两种共存形式进 行定量分析的液相色谱法， 但 是这种方法需要同时生成两种物质的标准 曲线， 增加检测工作量。 还有报道利用钴离子反 滴定的方法测定DTT含量， 但是DTT容易被氧化， 而且这种方法灵敏度也不高。 中国专利 CN107255660B公开了利用石墨烯 量子点电极来检测溶液中二硫 苏糖醇的方法， 这种方法操 作简单， 灵敏度高， 但是限于其制备工艺高昂的价格， 工业 生产中应用较少。 [0005]目前也有用HPLC对二硫苏糖醇(DTT)残留量进行定量的报道， 例如： 高效液相色谱 法测定药品中的二硫苏糖 醇和氧化型二硫苏糖醇 （分析科学学报  2016, 32:537‑540） 采用 HPLC测定了工程菌代谢产物 （一种活性蛋白） 中DTT的含量， 采用了Waters  X‑Bridge C18色 谱柱， 流动相为30:70 （v/v） 的甲醇 ‑水； 反相高效液相色谱法检测重组类病毒颗粒疫苗原液 中二硫苏糖醇的残留量 （中国生物制品学杂志2015,  28:1316‑1319） 采用反相HPLC测定了 重组HPV疫苗原液中DTT的残留量， 采用了DIKMA  Bio‑Bond C18色谱柱， 流动相为90:10 （v/ v） 水‑乙腈 （0～10  min） 、 100%乙腈 （10～15  min） 和90:10 （v/v） 水 ‑乙腈 （15～2 0 min） 。 但上 述的活性蛋白和重组HPV疫苗均具有明确的单一分子量蛋白结构， 而本申请涉及的巯基化 透明质酸衍生物为具有分散性的大分子多糖衍生物混合体， 研究表明上述两种检测方法很说　明　书 1/6 页 3 CN 115389681 A 3