(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211243476.9 (22)申请日 2022.10.12 (71)申请人 广东省农业科 学院动物科 学研究所 地址 510640 广东省广州市天河区五山大 丰一街1号 (72)发明人 胡胜兰　王丽　肖昊　温晓鹿　 吴胜男　崔百磊　 (74)专利代理 机构 广州专理知识产权代理事务 所(普通合伙) 44493 专利代理师 曲超 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/08(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种基于生物质谱的仔猪断奶应激性免疫 检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于生物质谱的仔猪断 奶应激性免疫检测方法， 利用液相色谱质谱 联用 仪分别检测试验仔猪血清样本和对照仔猪血清 样本， 对质谱进行校正由于样品差异随机性和免 疫球蛋白中多种重链多肽的复杂离子信号的波 动干扰； 进一步准确获得试验多肽列表和对照多 肽列表进行筛选， 得到由于断奶应激条件引起的 特征免疫性多肽段； 并根据特征免疫性多肽建立 应激响应强度变化曲线， 对试验仔猪在断奶应激 性条件下进行免疫功能评价， 从而达到对仔猪断 奶应激条件下的免疫功能分析的目的。 权利要求书4页 说明书11页 附图1页 CN 115308424 A 2022.11.08 CN 115308424 A 1.一种基于生物质谱的仔猪断奶应激性免疫检测方法， 其特征在于， 所述方法包括以 下步骤： S100， 获得试验仔猪血清样本和对照仔 猪血清样本； S200， 对试验仔猪血清样本和对照 仔猪血清样本分别进行预处理得到质谱试验样品和 质谱对照样品； S300， 利用液相色谱质谱联用仪检测质谱试验样品和质谱对照样品， 分别得到试验多 肽列表和对照多肽列表并进行筛 选得到特 征免疫性多肽； S400， 根据特征免疫性多肽建立应激响应强度变化曲线， 对试验仔猪在断奶应激性条 件下进行免疫功能评价。 2.根据权利要求1所述的一种基于生物质谱的仔猪断奶应激性免疫检测方法， 其特征 在于， 在S100中， 获得试验仔猪血清样本和对照仔猪血清样本的方法为： 选择N头健康断奶 仔猪作为实验对象， N∈[12,  81]； 按照体重相近的原则随机平均分为试验组和对照组， 日 粮选择分别饲喂基础饲粮和添加营养素的基础饲粮， 达到饲喂周期后分别得到试验仔猪备 采组和对照仔猪备采组； 分别随机抽选试验仔猪备采组和对照仔猪备采组中的2 n头仔猪进 行颈静脉采血获得血液样本， 总共2n个血液样本分别置于不同编号的真空促凝管中， 常温 静置30 min后进行离心分离得到对应编号范围在i 1∈[1,n]的试验仔猪血清样 本和编号范 围在i2∈[1,n] 的对照仔猪血清样本， 其中i1和i2分别为试验仔猪血清样本和对照仔猪血 清样本的编号序号， 置入冷冻箱零下20度中无菌保存备检。 3.根据权利要求1所述的一种基于生物质谱的仔猪断奶应激性免疫检测方法， 其特征 在于， 在S200中， 对试验仔猪血清样本和对照仔猪血清样本分别进行预处理得到质谱试验 样品和质谱 对照样品的方法为： S201， 在编号范围为i1∈[1,n]的试验仔猪血清样本中各个抽取(n ×10) uL混合获得 (n/100) mL的试验血清样本， 在编号范 围为i2∈[1,n]的对照仔猪血清样本中各个抽取(n ×10) uL混合获得(n/10 0) mL的对照血清样本； S202， 利用空白血清基质或者缓冲液对试验仔猪血清样本和对照 仔猪血清样本进行稀 释至与水相的体积比为3比1， 得到质谱试验样品和质谱 对照样品。 4.根据权利要求1所述的一种基于生物质谱的仔猪断奶应激性免疫检测方法， 其特征 在于， 在S 300中， 利用液相色谱质谱联用仪检测质谱试验样品和质谱对照样品， 分别得到试 验多肽列表和对照多肽列表， 并进行筛 选得到特 征免疫性多肽的方法为： S301， 利用液相色谱质谱联用仪分别对质谱试验样品和质谱对照样品进行检测， 设进 样次数为m， 分别得到m个试验质谱图和m个对照质谱图， m∈[3,10]； 其中， 质谱图的纵坐标 为离子丰度， 表示离子流的相对强度， 单位用百分数表示； 质谱图的横坐标为离子质荷比 值， 单位为m/z； S302， 对m个试验质谱图和m个对照质谱图进行归一化和谱线校正处理得到试验质谱曲 线和对照质谱曲线； S303， 将试验质谱曲线和对照质谱曲线进行数据库检索分析， 分别搜索得到免疫球蛋 白对应的若干条重链多肽构成试验多肽列表和对照多肽列表； S304， 获得试验多肽列表和对照多肽列表中对应各个多肽的离子质量， 由液相色谱质 谱联用仪分别得到试验多肽列表和对照多肽列表中各个多肽的离子质量对应的质量色谱权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115308424 A 2图， 并计算各个质量色谱图中对应多肽的离子强度 的积分记作各个多肽对应的色谱响应 值； S305， 对试验多肽列表和对照多肽列表进行统计学分析， 分别计算试验多肽列表和对 照多肽列表中各个多肽的差异显著性(P ‑value)， 将P ‑value≤0.05的各个多肽标记为差异 多肽； S306， 根据试验多肽列表和对照多肽列表中同一差异多肽对应的色谱响应值分别取 log2的对数并作差得到差异阈值， 并分别计算试验多肽列表和对照多肽列 表中各个差异多 肽的差异倍数， 筛选出差异 倍数大于或等于差异阈值的各个差异多肽标记为特征免疫性多 肽。 5.根据权利要求4所述的一种基于生物质谱的仔猪断奶应激性免疫检测方法， 其特征 在于， 在S302中， 对m个试验质谱图和m个对照质谱图进行归一化和谱线校正处理得到试验 质谱曲线和对照质谱曲线的方法为： 使用MaxQuant蛋白质组学软件对m个试验质谱图和m个 对照质谱图分别进 行归一化和谱线校正处理， 分别计算m个试验质谱图和m个对照质谱图在 相同离子质荷比对应的离子丰度的均值， 分别以横坐标为离子质荷比值、 纵坐标为离子丰 度的均值 导出得到试验质谱曲线和对照质谱曲线； 其中， 通过步骤S3021~S3026对m个试验质谱图和m个对照质谱图进行归一化和谱线校 正处理得到试验质谱曲线和对照质谱曲线： S3021， 对m个试验质谱图和m个对照质谱图进行归一化处理， 得到m个归一试验质谱图 和m个归一对照质谱图； S3022， 将各个归一试验质谱图和归一对照质谱图按编号排列， 在质谱扫描范围内随着 离子质荷比值从小到大顺序移动校正间隔， 将归一试验质谱图对应的校正间隔的宽度 表示 为W1 m/z， 将归一对照质谱图对应的校正间隔的宽度表示为W2  m/z， 分别在各个校正间隔 内查找离子丰度极小值， 分别按移动顺序录入得到第k 1个归一试验质谱图对应的极小丰度 试验质谱矩阵记作Min(xk1,yk1)， 其中k1值为归一试验质谱图的编号， k1∈[1,m]， yk1值为第 k1个归一试验质谱图在各个校正间隔内的离子丰度极小值， xk1值为yk1值对应的离子质荷 比值， xk1∈[X1, X2]， yk1∈[0,1]； 第k2个归一对照质谱图对应的极小丰度 对照质谱矩阵记 作Min(xk2,yk2)， 其中k2值为归一对照质谱图的编号， k2∈[1,m]， yk2值为第k2 个归一对照质 谱图在各个校正间隔内的离子丰度极小值， xk2值为yk2值对应的离子质荷比值， xk2∈[X1,  X2]， yk2∈[0,1]； X1为质谱扫描初始质荷比值， X2为质谱扫描结束质荷比值； S3023， 遍历k1的取值范围， 由极小丰度试验质谱矩阵进行校正计算得到试验质谱序列 记作Object(xk1,yk1)， 其计算公式为： ； ； ；权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 115308424 A 3