(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211471282.4 (22)申请日 2022.11.23 (71)申请人 天津外泌体科技有限公司 地址 300301 天津市滨 海新区滨 海科技园 康泰大道59号绿谷健康产业园22号楼 906 (72)发明人 葛啸虎　韩春乐　陆路　何磊　 王淼　王娜　高梦雅　孟晓竹　 温智钧　 (74)专利代理 机构 天津诺德知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 12213 专利代理师 王旭 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/34(2006.01)G01N 30/96(2006.01) (54)发明名称 一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法 (57)摘要 本发明公开一种基于二维液相评价外泌体 纯度的方法， 通过二维液相色谱仪采用尺寸排阻 法和离子交换色谱法结合的方法来评价外泌体 纯度； 样品首先进入液相色谱仪第一维的尺寸排 阻色谱柱， 采用第一维液相的流动相等度洗脱， 使外泌体进行首次分析； 再通过切换液相色谱仪 的六通阀， 对外泌体主峰部分进行中心切割进入 第二维的离子色谱柱对其进行捕捉收集， 通过第 二维的流动相梯度洗脱进入检测器进行第二次 分析。 本纯度评价方法操作简单， 自动化水平高， 占用时间短， 准确度高， 适合大批样品同时检测， 尤其适合未来外泌体大规模工业化生产的纯度 评价工作， 高效且过程可控。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 115541777 A 2022.12.30 CN 115541777 A 1.一种基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在于： 通过二维液相色谱评价外 泌体纯度； 第一维采用尺寸排阻色谱柱， 流动相等度洗脱； 第二维采用离子色谱柱， 流动相 梯度洗脱。 2.根据权利要求1所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在于： 先通过第 一维液相色谱对外泌体样本首次分析， 再切换六通阀对外泌体主峰进 行中心切割进入第二 维液相色谱。 3.根据权利要求2所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在于： 第 一维液 相色谱流动相为Tris缓冲液， pH值为7 ‑7.5； 第二维液相色谱流动相A为Tris缓冲液， 第二维 液相色谱流动相B为Tris缓冲液 ‑盐溶液； 流动相A和流动相B的pH值 为7‑7.5。 4.根据权利要求3所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在于： Tris缓冲 液浓度为20mM， 盐溶 液为NaCl溶液， NaCl盐浓度为1.0 M。 5.根据权利要求1 ‑4中任一所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在于： 第一维流动相洗脱条件为等度洗脱， 流动相流速为0.3 ‑0.6 ml/min， 液相六通阀切换阀时 间分别为3mi n‑3.8min。 6.根据权利要求5所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在于： 第 二维流 动相洗脱条件为流动相A和B梯度洗脱， 流动相流速为0.3ml/min， 包括多余两个的固定值洗 脱阶段； 包括0 ‑4.3min， 100%流动相A； 4.3 ‑5.0min， 100 ‑75%流动相A； 5.0 ‑5.1min， 75 ‑65%流 动相A； 5.1 ‑6.1min， 65%流动相A； 6.1 ‑6.2min， 65 ‑55%流动相A； 6.2 ‑7.2， 55%流动相A； 7.2 ‑ 7.3min， 55 ‑45%流动相A； 7.3 ‑8.3min， 45%流动相A； 8.3 ‑8.4min， 45 ‑35%流动相A； 8.4 ‑ 9.4min， 35%流动相A； 9.4 ‑9.5min， 35 ‑15%流动相A； 9.5 ‑10.5min， 15%流动相A； 10.5 ‑ 10.6min， 15‑0%流动相A； 10.6 ‑12min， 0%流动相A。 7.根据权利要求1 ‑4和6中任一所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在 于： 尺寸排阻色谱柱为Waters  BEH 450Ǻ SEC， 2.5 μm， 4.6 ×150mm； 离子交换色谱柱为阴离 子交换色谱柱为BIA  DEAE‑0.1 Analytical  Column， 1.3 μm。 8.根据权利要求1 ‑4和6中任一所述的基于二维液相评价外泌体纯度的方法， 其特征在 于： 在所得图谱中， 根据峰面积归一化法分别计算第一维液相色谱和第二维液相色谱中外 泌体纯度， 二 者的乘积即为所检测外泌体样本的纯度。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541777 A 2一种基于二维液相评价外泌体纯度的方 法 技术领域 [0001]本发明属于外泌体检测分析领域， 尤其是涉及一种基于二维液相评价外泌体纯度 的方法。 背景技术 [0002]外泌体是细胞分泌的脂质双层结构囊泡， 直径约为30~150nm， 外泌体广泛存在于 唾液、 细胞培养液、 乳液、 血液及尿液等多种体液中， 由于外泌体存在于多种复杂的生物环 境中， 不同来源甚至是同一来的外泌体在形态和生化特性方面都有着极大差异源。 外泌体 在疾病诊断和治疗领域有着广阔的应用前景， 获得较高纯度和质量的外泌体是科研及应用 的关键要素， 因此建立更准确而高效的评价外泌体纯度的方法显得至关重要。 [0003]目前评价外泌体纯度的方法有多种多样， 对于外泌体纯度分析并没有统一的标 准， 有蛋白/颗粒法、 q ‑PCR法、 纳米颗粒跟踪分析法等。 蛋白/颗粒法和q ‑PCR法检测方法耗 费时间过长、 样品配制方式复杂， 不适用于多批次大量检测； 而纳米颗粒跟踪分析法虽然检 测时间并不长， 但是只能测定部 分标记的的外泌体， 未标记的外泌体纯度无法测定， 准确度 不高， 因此存在一定的局限性。 [0004]液相色谱仪根据其分离模式不同可以分为反相色谱、 正相色谱、 离子交换色谱、 尺 寸排阻色谱、 亲和色谱。 尺寸排阻法是液相色谱仪 常用的检测方法， 尺寸排阻色谱柱里面填 充着一定 分子孔径的填料， 当样品流经色谱柱时， 大粒径的颗粒率先流出色谱柱， 小颗粒的 样品后流出， 因此可以达到不同粒径颗粒 的分离效果， 但是无法分析出与主成分物质颗粒 大小相近的杂质。 [0005]外泌体是带有电荷的， 外泌体的负电荷是由于其表面分子带负电荷导致的， 离子 色谱法被广泛应用于不同电荷分子的分离， 这些分子与色谱柱结合时被捕捉， 大量富集在 离子色谱柱上然后采用流动相将外泌体洗脱出来， 但是同样带电情况的杂质无法分析出 来， 这是单纯离子色谱法的局限性。 [0006]现有评价外泌体纯度的方法中， 例如， 专利 《一种从动 物血浆中分离外泌体并进行 纯度检测的方法》 采用q ‑PCR法测定外泌体纯度， q ‑PCR法对人员操作 专业性要求更高， 且实 验过程繁琐、 耗时长、 易污染； 专利 《从脐带间充质干细胞制备的外泌体制剂及其方法》 其中 采用纳米颗粒跟踪分析法测定测定纯度， 此方法只能测定部 分标记的的外泌体， 例如CD 63、 CD9、 CD81等， 但是未标记的外泌体纯度无法测定， 因此存在一定的局限性。 蛋白/颗粒法需 要分别检测蛋白浓度和 颗粒数， 需要结合两种检测方法 的结果， 检测时间较长。 q ‑PCR法同 样检测过程时间较长， 易污染， 且对人员专业操作要求高。 纳米颗粒跟踪分析法只能测定部 分标记的的外泌体， 但是未标记的外泌体纯度无法测定， 因此存在一定的局限性。 由于传统 液相存在的不 足 （如果主峰和杂质峰分离度较低或者重合无法进 行分析） ， 外泌体如果采用 液相方法检测纯度就需要克服 这一大难题。说　明　书 1/6 页 3 CN 115541777 A 3