(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211116596.2 (22)申请日 2022.09.14 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100850 北京市海淀区太平路27号 (72)发明人 何昆　朱颖洁　蒋欣　毛劼　王娜　 董方霆　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种动物肌肉中多种兽药残留的检测方法 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种动物肌肉中多种兽药残 留的检测方法及其应用， 所述检测方法操作简 便、 快捷、 溶剂用量少， 本发明首次将该方法应用 于动物源性食品兽药残留的检测中， 能够同时对 动物源性食品中固醇激素类、 磺脲类、 糖皮质激 素类、 非甾体类抗炎药、 磺胺类等高达15大类55 种兽药进行快速的定性、 定量分析， 尤其能够兼 顾强极性的头孢类(如头孢克洛、 头孢克肟)、 四 环素类抗生素(如四环素、 土霉素)和 弱极性的固 醇激素类药物(如苯丙酸诺龙)药物的同时检测， 检出限完全能够满足检测需求， 且检测效率大大 提升， 可在动物源性食品兽药残留的日常监督检 测领域获得广泛的应用。 权利要求书3页 说明书17页 附图5页 CN 115469029 A 2022.12.13 CN 115469029 A 1.一种动物肌肉中多种兽药残留的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包括如下步 骤： (1)样品溶液制备： 取动物肌肉样品， 绞碎， 称取2.00 ±0.02g样品， 加入3mL  0.1M EDTA 溶液涡旋振荡均质得到均质样品； 向均质样品中加入7mL乙腈涡旋振荡、 超声、 离心得到上 清液； 采用Oasis  PRiME HLB固相萃取柱和2mL甲醇对上清液进行净化洗脱， 得到的流出液 涡旋混匀、 旋转蒸发至 干， 用100 μL50％甲醇‑水溶液复溶得到待测样品溶 液； (2)标准工作溶液配制： 分别移取100μL  100mg/L的55种兽药标准品溶液于10mL容量 瓶， 加入50％甲醇 ‑水溶液定容， 得到浓度为1mg/L的混合标准溶液； 称取2.00 ±0.02g不含 55种兽药的空白动物肌肉样品， 进 行提取和净化后， 得到空白基质溶液； 用空白基质溶液将 混合标准溶液逐级稀释得到质量浓度为0.5、 1、 5、 10、 20、 50、 100 μg/L的系列基质混合标准 工作溶液， 用于标准工作曲线的绘制， 即基质匹配校准曲线； (3)超高效液相色谱 ‑串联质谱检测： 采用超高效液相色谱 ‑串联质谱仪对步骤(1)中得 到的样品溶 液进行检测， 所述超高效液相色谱 ‑串联质谱仪的参数如下： 色谱条件： Waters  Acquity UPLC HSS T3色谱柱， 柱温35℃， 进样量5μL， 流速0.4mL/ min， 流动相A为含0.1％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液， 流动相B为含0.1％甲酸和1mM甲酸铵的 乙腈， 洗脱方式为梯度洗脱， 梯度洗脱程序为： 0 ‑0.5min 5％B， 0.6 ‑2min 20％‑40％B， 2‑ 5min 40％‑55％B， 5‑5.5min 55％‑99％B， 5.5 ‑8.5min 99％B， 8.6min  5％B， 8.6 ‑10min  5％B； 质谱条件： 电喷雾离子源(ESI+/ESI ‑)， 离子源 喷雾电压： 正离子模式5500V， 负离子模 式‑4500V； 离子源温度(TEM)350℃， 气帘气(Curtain  gas)35psi， 雾化气(Gas  1)65psi， 辅 助加热气(Gas  2)55psi， 质谱扫描方法为多 时间段的多反应检测扫描方法， 即确定每个化 合物的保留时间后， 在其保留时间前后60 s对它的离子对进 行监测， 手动调谐优化55种兽药 母离子和子离子， 选取两组灵敏度最佳 的离子对作为定量离子对和定性离子对， 获得最佳 的去簇电压(D P)和碰撞能量(C E)， 最终得到优化的质谱 采集参数； 所述55种兽药包括甲睾酮、 苯丙酸诺龙、 醋酸甲羟孕酮、 格列美脲、 格列本脲、 可的松、 氢化可的松、 醋酸氢化可的松、 哈西奈德、 地塞米松、 醋酸地塞米松、 倍他米松戊酸酯、 吲哚 布洛芬、 卡洛芬、 双氯芬酸、 吲哚美辛、 氟芬那酸、 磺胺噻唑、 磺胺甲基嘧啶、 磺胺甲噻二唑、 磺胺间二甲氧嘧啶、 磺胺嘧啶、 磺胺二甲基嘧啶、 咪哒 唑仑、 阿普唑仑、 地西泮、 甲硝唑、 阿苯 达唑、 替硝唑、 莱克多巴胺盐酸盐、 沙丁胺醇、 盐酸克伦特罗、 西马特罗、 氯丙那林、 培氟沙 星、 环丙沙星、 恩诺沙星、 诺氟沙星、 红霉素、 罗红霉素、 林可霉素、 克林霉素、 四环素、 土霉 素、 金霉素、 头孢氨 苄、 头孢克洛、 头孢克肟、 头孢喹肟、 头孢拉定、 金刚烷胺、 金刚乙胺、 甲砜 霉素、 氟苯尼考、 氯霉素。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述涡旋振荡的条件为 2500rpm/min转速下涡旋振荡5mi n。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述超声、 离心的条件为超 声5min， 以10000rpm/min转速离心5min。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述净化洗脱具体包括如 下步骤： 取1mL上述上清液， 流过Oasis  PRiME HLB固相萃取柱将其润湿并弃去流出液， 然后 取4mL上清液以1滴/s流速通过Oasis  PRiME HLB固相萃取柱， 再以2mL甲醇通过Oasis  权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115469029 A 2PRiME HLB固相萃取柱进一步洗脱， 将全部流出液涡旋混匀并取600 μL旋转蒸发至干， 用100 μL 50％甲醇‑水溶液复溶， 以15 000rpm/min转速离心5min得到待测样品溶 液。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述Oasis  PRiME HLB固相 萃取柱的参数规格为6mL、 20 0mg。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述Waters  Acquity UPLC  HSS T3色谱柱的参数规格为2.1m m×100mm， 1.7 μm。 7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述手动调谐优化的过程 包括如下步骤： 将 55种兽药的0.1mg/L标准溶液分别通过针泵进样方式进行质谱方法调谐， 在ESI+和ESI ‑模式下进行扫描， 手动调谐优化55种 兽药母离子和子离子， 选取两组灵敏度 最佳的离子对作为定量离子对和定性离子对， 获得最佳的去簇电压和碰撞 能量， 在优化的 质谱参数和液相条件下， 多反应监测扫描模式采集55种兽药混合标准溶液的质谱信号， 确 认每一种兽药的保留时间， 最终采用多时间段的多反应检测扫描方法对55种兽药进行检 测。 8.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法还包括数据处理与分 析， 所述数据处理与分析包括如下步骤： Analyst  1.7采集样品数据后， 在Sciex  OS 1.7.0 中对数据进 行处理， 自动计算化合物定性离子对与定量离子对峰面积比值(相对离子丰度， Ion Ratio)， 根据预先设置的相对离子丰度规则和化合物保留时间定性判定化合物的检 出， 积分所得定量离子对峰面积自动代入基质匹配标准曲线对样品中55种兽药残留进行定 量检测。 9.一种动物肌肉中多种兽药残留检测的处理方法， 其特征在于， 所述处理方法包括如 下步骤： (a)绞碎与均质： 取动物肌肉样品， 绞碎， 称取2.00 ±0.02g样品， 加入3mL0.1M  EDTA溶 液涡旋振荡均质得到均质样品； (b)样品中兽药的提取： 向均质样品中加入7mL乙腈涡旋振荡、 超声、 离心得到上清液； (c)净化洗脱： 采用Oasis  PRiME HLB固相萃取柱和2mL甲醇对上清液进行净化洗脱， 得 到的流出 液涡旋混匀、 旋转蒸发至 干， 用100 μL 50％甲醇‑水溶液复溶得到待测样品溶 液； 优选地， 步骤(a)中所述涡旋振荡的条件为25 00rpm/min转速下涡旋振荡5mi n； 优选地， 步骤(b)中所述涡旋振荡的条件为25 00rpm/min转速下涡旋振荡5mi n； 优选地， 步骤(b)中所述超声、 离心的条件为超声5mi n， 以10000rpm/min转速离心5min； 优选地， 步骤(c)中所述净化洗脱具体包括如下步骤： 取1mL上述上清液， 流过Oasis   PRiME HLB固相萃取柱将其润湿并弃去流出液， 然后取4mL上清液以1滴/s流速通过Oasis   PRiME HLB固相萃取柱， 再以2mL甲醇通过Oasis  PRiME HLB固相萃取柱进一步洗脱， 将全部 流出液涡旋混匀并取600μL旋转蒸发至干， 用100μL  50％甲醇 ‑水溶液复溶， 以15000rpm/ min转速离心5min得到待测样品溶 液； 优选地， 步骤(c)中所述Oasis  PRiME HLB固相萃