(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211180197.2 (22)申请日 2022.09.27 (71)申请人 华熙生物科技股份有限公司 地址 250101 山东省济南市高新 技术开发 区天辰大街678号 (72)发明人 刘英　陈玉娟　周宁　 (74)专利代理 机构 北京唐颂永信知识产权代理 有限公司 1 1755 专利代理师 刘伟 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/74(2006.01) G01N 30/96(2006.01) (54)发明名称 一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法 (57)摘要 本申请提供了一种分离测定丙氨酸酯类盐 含量的方法， 采用氨基酸分析仪， 以阳离子交换 树脂柱为分离柱， 以流动相进行梯度洗脱， 利用 柱后衍生化反应测定丙氨酸酯类 盐的含量。 本申 请使用氨基酸自动分析仪， 茚三酮为柱后衍生化 试剂， 并使用醋酸钠作为流动相进行分离， 可 以 很好的将丙氨 酸酯类盐与其他组分分离， 测得丙 氨酸酯类 盐含量， 方法准确度高， 重复性好， 检测 限低。 权利要求书1页 说明书17页 附图1页 CN 115541749 A 2022.12.30 CN 115541749 A 1.一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 采用氨基酸分析仪， 以阳离子交换树脂柱为分离柱， 以流动相进行梯度洗脱， 利用衍生 化试剂和反应柱进行衍 生化反应后， 采用光度法测定丙氨酸酯类盐的含量。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述流动相为无机溶剂， 优选， 所述无机溶 剂为无机酸或其盐、 无机 碱、 乙醇中任意 一种或任意两种的混合物。 3.根据权利要求1 ‑2中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述衍生化试剂包括衍生化反 应试剂和衍 生化缓冲液。 4.根据权利要求1 ‑3中任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述 流动相包括： 流动相A， 为磷酸和乙醇的水 溶液， 优选， 磷酸10 ‑20wt％、 乙醇5 ‑15wt％； 流动相B， 为磷酸和醋酸钠的水 溶液， 优选， 磷酸2 ‑10wt％、 醋酸钠5 ‑10wt％； 流动相C， 为醋酸钠的水 溶液， 优选， 醋酸钠溶 液2‑10wt％； 流动相D， 为醋酸钠和乙醇的水 溶液， 优选， 醋酸钠5 ‑10wt％、 乙醇0.5 ‑5wt％， 流动相E， 为乙醇和氢 氧化钠的水 溶液， 优选乙醇溶 液60‑85wt％、 氢 氧化钠0.5 ‑5wt％。 5.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述 衍生化试剂包括， 衍生化反应试剂R 1， 30‑50mg/mL茚三酮丙二醇溶 液； 衍生化缓冲液R2， 15 ‑25mg/mL乙酸钠+20 ‑60mg/mL乙二醇； 衍生化缓冲液R3， 4 ‑6％乙醇溶 液。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于， 所述梯度洗脱和衍 生化反应条件 包括： 采用流动相A； 随后， 采用流动相B； 随后， 采用流动相C； 随后， 采用流动相A； 随后， 采用流动相D， 衍 生化反应试剂R 1， 衍生化缓冲液R2； 随后， 采用流动相D， 衍 生化反应试剂R 1， 衍生化缓冲液R2； 随后， 采用流动相E， 衍 生化缓冲液R3； 随后， 采用流动相A。 7.根据权利要求1 ‑6中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述分离柱为强酸型阳离子交 换树脂柱， 优选为含有磺酸基的阳离子交换树脂柱， 所述反应柱的填充物为石英砂或者是 金刚砂。 8.根据权利 要求1‑7中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述分离柱柱温为50 ‑60℃； 所 述反应柱 柱温为125 ‑140℃。 9.根据权利要求1 ‑8中任一项所述的方法， 其特征在于， 所述光度法的检测波长为 550nm‑575nm。 10.根据权利要求1 ‑9中任一项所述的方法， 其特征在于， 进样到所述分离柱的进样量 为10‑30 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541749 A 2一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方 法 技术领域 [0001]本申请涉及分析分离领域， 具体涉及丙氨酸酯类盐含量的分离和 测定的方法。 背景技术 [0002]β‑丙氨酸甲酯盐酸盐又叫3 ‑氨基丙酸甲酯盐酸盐， 是一种细粉末晶体， 易溶于水， 不溶于或微溶于丙酮。 其生产工艺主要采用酶转化法。 可用作食品添加剂， 饲料、 医药中间 体。 [0003]β‑丙氨酸甲酯盐酸盐在医药及农药中间体的制备方面有着重要的应用， 同时β ‑丙 氨酸甲酯盐酸盐是合成肌肽等的重要原料。 [0004]专利CN201310298964.4公开了采用N ‑BOC‑β‑丙氨酸甲酯盐酸盐与L ‑组氨酸在强 碱催化下胺解反应， 酸脱氨基保护， 制备 得到L‑肌肽。 [0005]专利CN201810357806.4公开了采用L ‑组氨酸、 去离子水、 β ‑丙氨酸甲酯盐酸盐， 用 碱性溶液调节pH值至7.0 ‑9.0， 加入酶， 进行酶反应制备L ‑肌肽， 离心、 超滤、 纳滤、 上柱、 浓 缩、 搅拌、 析晶等工艺得到肌肽粗品， 析晶、 搅拌析晶、 放料离心、 减压真空干燥等工艺得肌 肽精品。 [0006]在使用 β‑丙氨酸甲酯盐酸盐进行医药及农药或肌肽的制备过程中， 因工艺多繁琐 冗长， 制备过程中的中间产物或粗品或精品中往往不同程度的残留β ‑丙氨酸甲酯盐酸盐， 对β‑丙氨酸甲酯盐酸盐含量进 行分析和检测有助于对肌肽等转化和纯化方法的评估， 及时 有效控制转 化或反应条件， 提高产率。 发明内容 [0007]为了解决上述问题， 本申请提供一种丙氨酸酯类盐的检测方法， 利用氨基酸分析 仪， 茚三酮做 为衍生化试剂， 采用柱后衍生技术， 回收率高、 重现性好， 精密度高， 检测限低， 能够实现对丙氨酸酯类盐高效、 准确及快速检测。 [0008]具体的， 本申请采用的技 术方案是： [0009]1、 一种分离测定丙氨酸酯类盐含量的方法， 包括如下步骤： [0010]采用氨基酸分析仪， 以阳离子交换树脂柱为分离柱， 以流动相进行梯度洗脱， 利用 衍生化试剂和反应柱进行衍 生化反应后， 采用光度法测定丙氨酸酯类盐的含量。 [0011]2、 根据项1所述 的方法， 其所述流动相为无机溶剂， 优选， 所述无机溶剂为无机酸 或其盐、 无机碱、 乙醇中任意一种或任意两种的混合物， 所述无机酸 或其盐优选为磷酸和醋 酸钠； 所述无机 碱优选为氢 氧化钠。 [0012]3、 根据项1 ‑2中任一项所述的方法， 所述衍生化试剂包括衍生化反应试剂和衍生 化缓冲液， 优选， 所述 衍生化反应试剂为邻苯二甲醛或茚三酮试剂。 [0013]4、 根据项1 ‑3中任一项所述的方法， 所述 流动相包括： [0014]流动相A， 为磷酸和乙醇的水 溶液， 优选， 磷酸10 ‑20wt％、 乙醇5 ‑15wt％； [0015]流动相B， 为磷酸和醋酸钠的水 溶液， 优选， 磷酸2 ‑10wt％、 醋酸钠5 ‑10wt％；说　明　书 1/17 页 3 CN 115541749 A 3